该协议提供了一种以安全，简单和有效的方式将基因疗法递送到多个眼组织的方法。它也适用于小动物的基质内和视网膜下注射。使用结膜下注射途径是微创的。
它带来的风险较小，并且对于AV输送治疗多种眼部疾病具有很大的希望。全世界有超过10亿人患有视力障碍，使用安全简便的药物输送方法为治疗许多不同原因的失明提供了广泛的适用性。该协议中描述的基因递送方法对于那些正在开发潜在干预策略和执业眼科医生的人来说特别感兴趣，他们最终将这些药物交付给患者。
对于第一次执行此协议的人来说，最大的挑战可能是将针插入概念结膜空间。首先，通过将体视显微镜和注射泵放置在生物安全柜中来组装注射系统。接下来，将聚乙烯管切割成大约 50 厘米的长度。
将 36 号针头的末端插入管子的一端。然后用无菌水填充一次性3毫升注射器，并将其插入针头对面的管子侧面。冲洗管道三次，在无菌水和70%酒精之间交替对管道进行消毒，并确保整个管道没有泄漏，堵塞或损坏。
使用一次性3毫升注射器，用无菌水填充管子，并将管子连接到一次性注射器上。然后将一块副泡沫放在生物安全柜的表面上，并向其中添加一池无菌水。将连接到针头的管道部分浸入无菌水池中。
接下来，将一次性注射器从管口拉出，以防止任何空气在取出注射器时进入管路系统。然后用无菌水填充10微升汉密尔顿注射器。接下来，通过将汉密尔顿注射器的针尖浸入副膜上的无菌水池中，将汉密尔顿注射器针头连接到管路的开口端。
按住泵屏幕上的快速反向按钮，将推杆块移动到注射器的近似长度。接下来，拧下支架夹紧旋钮以松开推杆和注射器支架块上的固定支架。随后，将汉密尔顿注射器装载到注射器支架块上，并按照制造商的说明固定注射器。
要在泵设置屏幕中调整参数，请按“力”按钮并将力水平设置为 30%然后接受更改以返回设置屏幕。按“快速启动”按钮，选择“方法”，然后选择“仅注入”选项。对于注射器选项，选择汉密尔顿 1700，然后单击玻璃“并选择 10 微升。
稍后，选择输液速率和注射量。按下“注入”按钮，从汉密尔顿注射器中弹出水，同时让管道和注射针充满水。接下来，通过将注射针头放入病毒原液的等分试样中来提取病毒。
然后通过按下反向按钮稍微拉回汉密尔顿注射器，在管中引入一个小气泡。麻醉动物后，用镊子抓住结膜。然后将针头插入结膜，直到斜面完全被结膜覆盖，然后将针头放在眼球上。
同时，通过使用脚踏开关按下“开始”按钮来开始注射。为了检查AAV载体的分布，用苏木精和伊红对眼部和周围组织进行染色。代表性矢状切片表明，印度墨水的分散主要发生在眼周松散结缔组织中巩膜外表面的眼外肌附近。
为了确认注射后八周自辅AAV 8的转导，通过免疫荧光染色检查横截面中的绿色荧光蛋白丰度。结果表明，AAV 8载体有效地转导了眼睛和角膜后方的眼周肌肉。为了分析载体生物分布，使用转基因特异性引物和探针通过定量聚合酶链反应检查载体基因组拷贝数和其他器官（包括肝脏和心脏）中的不同眼室。
定量逆转录聚合酶链反应证实了转基因的表达，这表明结膜下注射AAV 8导致眼睑、结膜、角膜和视神经中的转基因表达。气泡将作为管中的水和治疗药物之间的屏障。该技术允许其他研究人员探索结膜下给药途径用于眼科溶液和多种疾病的眼部基因治疗。
