يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوصيل العلاج الجيني إلى أنسجة العين المتعددة بطريقة آمنة وسهلة وفعالة. كما أنه قابل للتكيف مع الحقن داخل اللحمة وتحت الشبكية في الحيوانات الصغيرة. استخدام طريق الحقن تحت الملتحمة هو الحد الأدنى الغازية.
إنه يشكل مخاطر أقل ويبشر بتسليم AV لعلاج أمراض العين المتعددة. مع وجود أكثر من 1 مليار شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من ضعف البصر ، فإن استخدام طريقة آمنة وسهلة لتوصيل الأدوية يوفر قابلية تطبيق واسعة لعلاج العديد من الأسباب المختلفة للعمى. تعتبر طرق توصيل الجينات الموصوفة في هذا البروتوكول ذات أهمية خاصة لأولئك الذين يطورون استراتيجيات التدخل المحتملة وأطباء العيون الممارسين ، الذين سيقدمون هذه الأدوية في النهاية للمرضى.
من المحتمل أن يكون التحدي الأكبر الذي يواجه الشخص الذي يقوم بتنفيذ هذا البروتوكول لأول مرة هو إدخال الإبرة في مفهوم مساحة الملتحمة. للبدء ، قم بتجميع نظام الحقن عن طريق وضع مجهر ستيريو ومضخة حقنة في خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، قم بقطع أنبوب البولي إيثيلين بطول حوالي 50 سم.
أدخل نهاية إبرة قياس 36 في أحد طرفي الأنبوب. ثم املأ حقنة سعة 3 ملليلتر يمكن التخلص منها بالماء المعقم وأدخلها في جانب الأنبوب المقابل للإبرة. اغسل الأنبوب ثلاث مرات ، بالتناوب بين الماء المعقم والكحول بنسبة 70٪ لتطهير الأنبوب والتأكد من عدم وجود تسرب أو انسداد أو تلف في جميع أنحاء الأنبوب.
باستخدام حقنة 3 ملليلتر التي تستخدم لمرة واحدة ، املأ الأنبوب بالماء المعقم واترك الأنبوب متصلا بالمحقنة التي تستخدم لمرة واحدة. ثم ضع قطعة من البارافوم على سطح خزانة السلامة الحيوية ، وأضف بركة من الماء المعقم إليها. اغمر جزء الأنبوب المتصل بالإبرة في بركة الماء المعقم.
بعد ذلك ، اسحب المحقنة التي تستخدم لمرة واحدة من فتحة الأنبوب لمنع أي هواء من دخول نظام الأنابيب عند إزالة المحقنة. ثم املأ حقنة هاملتون سعة 10 ميكرولتر بالماء المعقم. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة حقنة هاملتون بالطرف المفتوح للأنبوب عن طريق غمر طرف إبرة حقنة هاملتون في بركة الماء المعقم على فيلم الفقرة.
اضغط مع الاستمرار على الزر العكسي السريع على شاشة المضخة لتحريك كتل الدفع إلى الطول التقريبي للمحقنة. بعد ذلك ، قم بفك مقابض تثبيت الدعامة لفك أقواس التثبيت الموجودة على الدافع وكتل حامل المحقنة. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة هاملتون على كتلة حامل المحقنة وقم بتأمين المحقنة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
لضبط المعلمات في شاشة إعداد المضخة ، اضغط على زر "القوة" واضبط مستوى القوة على 30٪ ثم اقبل التغييرات للعودة إلى شاشة الإعداد. اضغط على زر البدء السريع ، وحدد الطريقة ، ثم حدد خيار Infuse Only. بالنسبة لخيار المحقنة ، حدد Hamilton 1700 ، ثم انقر فوق زجاج"وحدد 10 ميكرولتر.
في وقت لاحق ، حدد معدل التسريب وحجم الحقن. أخرج الماء من حقنة هاملتون مع ترك الأنبوب وإبرة الحقن مليئة بالماء عن طريق الضغط على زر Infuse. بعد ذلك ، اسحب الفيروس عن طريق وضع إبرة الحقن في حصص من مخزون الفيروس.
ثم اسحب حقنة هاملتون قليلا عن طريق الضغط على الزر العكسي لإدخال فقاعة هواء صغيرة في الأنبوب. بعد تخدير الحيوان ، أمسك الملتحمة بالملقط. ثم أدخل الإبرة في الملتحمة حتى يتم تغطية شطبة بالكامل بواسطة غشاء الملتحمة ، ووضع الإبرة على الكرة الأرضية.
في نفس الوقت ، ابدأ الحقن بالضغط على زر "ابدأ" باستخدام مفتاح القدم. لفحص توزيع ناقل AAV ، تم تلطيخ الأنسجة العينية والأنسجة المحيطة بالهيماتوكسيلين واليوزين. أظهرت المقاطع السهمية التمثيلية أن تشتت الحبر الهندي حدث بشكل رئيسي بجوار العضلات خارج العين في السطح الخارجي للصلبة في الأنسجة الضامة الرخوة حول العين.
لتأكيد نقل AAV 8 الذاتي في ثمانية أسابيع بعد الحقن ، تم فحص وفرة البروتين الفلوري الأخضر في المقاطع العرضية عن طريق تلطيخ التألق المناعي. كشفت النتائج أن ناقلات AAV 8 نقلت بكفاءة عضلات العين الخلفية إلى العين والقرنية. لتحليل التوزيع الحيوي للناقل ، تم فحص أرقام نسخ جينوم النواقل ومقصورات العين المميزة في الأعضاء الأخرى ، بما في ذلك الكبد والقلب ، عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي باستخدام البادئات والمجسات الخاصة بجين التحوير.
تم تأكيد التعبير عن جين التحوير من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي ، والذي اقترح أن الحقن تحت الملتحمة ل AAV 8 يؤدي إلى تعبير الجينات المحورة في الجفن والملتحمة والقرنية والعصب البصري. ستكون فقاعة الهواء بمثابة حاجز بين الماء في الأنبوب والدواء العلاجي. تسمح هذه التقنية للباحثين الآخرين باستكشاف استخدام طريق الإعطاء تحت الملتحمة لكل من محاليل العيون والعلاجات الجينية العينية لأمراض متعددة.
