El pez cebra es un modelo atractivo, pero los científicos no saben cuánto está tomando el organismo con la dosificación en el agua. Desarrollamos una técnica para digerir el tejido después de la exposición y cuantificar los metales a través de ICPMS. Esta técnica nos permite cuantificar y validar con precisión la respuesta a la dosis utilizando ICPMS.
Este método tiene mucho potencial. Las exposiciones farmacológicas o ambientales a metales se pueden aplicar desde el nivel celular hasta sistemas de órganos completos en modelos animales. Agregue aproximadamente 0,25 mililitros de ácido nítrico de alta pureza a los tubos centrífugos de polipropileno de 15 mililitros para hasta 10 larvas.
Ultrasonicar durante una hora para predigerir las muestras. Para la ultrasonicación, realice ciclos cortos de digestión de tejidos con intervalos de cinco minutos en un digestor de microondas seguro para ácidos hasta que todo el tejido se oxide visiblemente, produciendo una solución amarilla uniforme y transparente. Controle cuidadosamente la integridad de los tubos para evitar la ruptura y realizar giros cortos en la centrífuga entre ciclos.
Una vez que el tejido esté visiblemente oxidado, diluya las muestras en una campana de humos a ácido nítrico al 3,5% utilizando 6,75 mililitros de agua de alta pureza y vórtice para mezclar bien. Luego, para llevar a cabo una curva de calibración de 7 puntos emparejada con la matriz para tener en cuenta cualquier interferencia isobárica potencial. Usando una concentración de stock del estándar elemental certificado acuoso, tome una alícuota de 0.1 mililitros y por pipeta en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Diluir con ácido nítrico al 3,5% a un volumen final de 10 mililitros para producir 10 partes por billón de soluciones estándar. Usando el stock de 10 partes por billón, haga que las diluciones en serie sean 0.1, 1.0 y 5.0 partes por mil millones de soluciones estándar en 3.5% de ácido nítrico. Usando el stock 0.1, haga las diluciones en serie 0.001, 0.005 y 0.01 partes por mil millones de soluciones estándar en 3.5% de ácido nítrico.
Luego, antes de preparar el instrumento ICPMS para el análisis de muestras, asegúrese de que la válvula de gas argón esté abierta, que todos los tubos estén bien conectados y limpios, que el ácido nítrico al 5% esté abierto para enjuagar los tubos y la cristalería entre los análisis de muestras. Compruebe el estado de la antorcha y los conos y asegúrese de que la caja de la antorcha esté bien sujeta. Y el tubo de drenaje de la cámara de pulverización está conectado correctamente a la peribomba.
Abra el software, verifique las lecturas de vacío y asegúrese de que todas las bombas turbo funcionen al 100%, haga clic en START en la ventana de estado del sistema de control de plasma para iniciar la secuencia de inicio. Encienda la bomba de plasma y el enfriador de plasma, coloque el nebulizador y encienda el plasma. Espere a que el plasma esté encendido y estable cuando la ventana Estado indique que la secuencia de inicio se ha completado.
En este punto, observe los puntos verdes en la ventana de estado del sistema que indican que todas las fuentes de alimentación están encendidas. En la barra de menús, haga clic en Control, Muestreador automático en el menú desplegable. Ingrese la posición del bastidor de muestreo automático para el tubo que contiene ácido nítrico al 5%, permita que el ácido ingrese al plasma.
En la barra de menús, haga clic en Escaneos, imán en el menú desplegable. En la ventana MagnetScan, escriba 115 en la posición de masa del marcador y haga clic en Entrar. Permita que el imán escanee a través del rango de masa durante 30 minutos mientras el instrumento se calienta.
Después de 30 minutos, utilice el control de muestreo automático para pasar a la posición de una solución de ajuste multielemento de una pieza por billón. Aspire la solución de afinación y ajuste el instrumento para optimizar la lectura de la señal. Ajuste la posición de la antorcha para las coordenadas X, Y, Z, de modo que la antorcha se alinee con el centro de los conos y el caudal del nebulizador en la ventana Control de plasma.
Realice los ajustes necesarios en la ventana Sintonización de óptica de iones para la fuente, el detector y el analizador. Una vez optimizada la lectura de la señal, haga clic en Detener en la ventana Magnet Scan, haga clic en Calibrar magnet y seleccione low resolution en la ventana emergente. Haga clic en Aceptar y abra el archivo smc de calibración masiva para calibrar el imán.
Haga clic en Guardar, Usar para aplicar la calibración del imán actual a los análisis. Al medir muestras desconocidas con un amplio rango de concentraciones, realice una calibración del detector para comparar las señales de recuento de pulsos iónicos a bajas concentraciones con las señales de iones atenuadas producidas a concentraciones más altas. Inicie el análisis de muestras haciendo clic en Adquisición de datos y, a continuación, haga clic en Configuración del método en el menú desplegable.
Utilice un método existente proporcionado por el fabricante o cree un método basado en los elementos de interés. Si es necesario, ajuste el modo de análisis, el tiempo de permanencia, el retardo del interruptor, el número de barridos y ciclos, la resolución, el modo de detección y la masa de estacionamiento para la configuración del deflector. Haga clic en Guardar para registrar la configuración del método.
Optimizar los parámetros para cada metal e isotipo. En la barra de menú, haga clic en Adquisición de datos. Haga clic en Ejecución por lotes en el menú desplegable.
Alternativamente, haga clic en el icono BATCH debajo de la barra de menús, importe los parámetros del lote desde una hoja de cálculo o cree una secuencia en la ventana Batch Run. Introduzca el tipo de muestra, la posición del bastidor del muestreador automático, el tiempo de transferencia, el tiempo de lavado, las réplicas, el ID de muestra y el archivo de método. Organice la ejecución por lotes para soluciones estándar para la curva de calibración, seguida de un estándar de control de calidad, luego muestras desconocidas.
Supervise la deriva del instrumento y la reproducibilidad de la muestra incluyendo un estándar de control de calidad de 0,5 partes por billón cada 5 a 10 muestras. Se realizaron estudios de captación de tejidos con exposiciones transmitidas por el agua de cisplatino y un nuevo compuesto anticancerígeno a base de rutenio PMC79. La letalidad y el retraso en la eclosión se evaluaron para las concentraciones nominales de cisplatino.
0, 3.75, 7.5 15, 30 y 60 miligramos por litro de cisplatino. La acumulación de platino en el tejido del organismo se determinó mediante el análisis de ICPMS y el tejido del organismo contenía dosis respectivas de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 y 461,9 nanogramos por organismo. Se observó un retraso en la eclosión en todas las concentraciones de cisplatino.
Después de la decororonación, los coriones se recolectaron y analizaron para el platino por separado. Las dosis no letales de cisplatino utilizadas para estudios de decorolinación determinaron que del 93 al 96% de la dosis total administrada de cisplatino se había acumulado en el corion, con la dosis restante dentro del tejido larvario. Las larvas de pez cebra fueron expuestas a 0, 3.1, 6.2, 9.2 y 12.4 miligramos por litro de PMC79.
Estas concentraciones se determinaron analíticamente para contener 0, 0.17, 0.44, 0.66 y 0.76 miligramos por litro de rutenio. A diferencia de este cisplatino, no se observó un retraso en la eclosión en las larvas expuestas a PMC79. Los coriones no se incluyeron en el análisis de rutenio ya que se degradaron naturalmente antes de la recolección larvaria.
El metal masivo dentro de los tejidos larvales analizado en cada concentración fue de 0,19, 0,41 y 0,68 nanogramos de rutenio por larva. Cualquiera de los reactivos añadidos al protocolo de exposición dan el potencial de interferencias isobáricas. Cuando sea posible, considere alternativas como el enfriamiento rápido en comparación con la tricaína.
Este método permite comparar la cuantificación de la dosis de metales para la toxicidad, la eficacia y los experimentos entre vertebrados superiores. Estábamos especialmente emocionados de que nuestra dosis umbral estuviera dentro de un orden de magnitud administrado a los pacientes.
