O zebrafish é um modelo atraente, mas os cientistas não sabem o quanto o organismo está se levantando com a dosagem transmitida pela água. Desenvolvemos uma técnica para digerir tecido após exposição e quantificar metais via ICPMS. Esta técnica nos permite quantificar com precisão e validar a resposta da dose usando ICPMS.
Este método tem muito potencial. Exposições farmacológicas ou ambientais de metais podem ser aplicadas do nível celular até sistemas inteiros de órgãos em modelos animais. Adicione aproximadamente 0,25 mililitros de ácido nítrico de alta pureza aos tubos de centrífugas de polipropileno de 15 mililitros para até 10 larvas.
Ultrassonicar por uma hora para prenípulo as amostras. Para a ultrassonificação, realize ciclos curtos de digestão tecidual com intervalos de cinco minutos em um digestor de micro-ondas seguro ácido até que todo o tecido esteja visivelmente oxidado, produzindo uma solução amarela uniforme e clara. Monitore cuidadosamente a integridade dos tubos para evitar rupturas e faça pequenos giros na centrífuga entre os ciclos.
Uma vez que o tecido esteja visivelmente oxidado, dilua as amostras em uma capa de fumaça para 3,5% de ácido nítrico usando 6,75 mililitros de água de alta pureza e vórtice para misturar completamente. Em seguida, para conduzir uma curva de calibração de 7 pontos combinada com matriz para explicar quaisquer possíveis interferências isobáricas. Usando uma concentração de estoque do padrão elementar certificado aquoso, pegue uma alíquota de 0,1 mililitro e, por pipeto, em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Diluir com ácido nítrico de 3,5% a um volume final de 10 mililitros para produzir 10 partes por bilhão de soluções padrão. Usando as 10 partes por bilhão de ações, faça com que as diluições seriais 0,1, 1,0 e 5,0 partes por bilhão de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%. Usando o estoque de 0,1, faça as diluições seriais 0,001, 0,005 e 0,01 partes por bilhão de soluções padrão em ácido nítrico de 3,5%.
Em seguida, antes de preparar o instrumento ICPMS para análise de amostras, certifique-se de que a válvula de gás argônio está aberta, toda a tubulação está conectada e limpa, 5% de ácido nítrico está aberto para enxaguar tubos e vidros entre as análises amostrais. Verifique as condições da tocha e dos cones e certifique-se de que a caixa da tocha está bem travada. E o tubo de drenagem da câmara de pulverização está conectado corretamente ao peripump.
Abra o software, verifique as leituras de vácuo e certifique-se de que todas as bombas turbo estejam funcionando a 100% Clique em INICIAR na janela de status do sistema plasma control para iniciar a sequência inicial. Ligue a bomba de plasma e o refrigerador de plasma, coloque o nebulizador e acenda o plasma. Aguarde que o plasma esteja aceso e estável quando a janela Status indicar que a sequência de inicialização está completa.
Neste ponto, observe os pontos verdes na janela do estado do sistema que indicam que todas as fontes de alimentação estão desligada. Na barra de menu, clique em Control, Autosampler no menu suspenso. Digite a posição do rack do autosampler para o tubo contendo ácido 5% nítrico, deixe o ácido entrar no plasma.
Na barra de menu, clique em Scans, Magnet no menu suspenso. Na janela MagnetScan, digite 115 na Posição de Massa do Marcador e clique em enter. Deixe o ímã escanear toda a faixa de massa por 30 minutos enquanto o instrumento se aquece.
Após 30 minutos, use o controle do autosampler para passar para a posição de uma solução de ajuste multielement de uma peça por bilhão de litros. Aspire a solução de sintonia e sintonize o instrumento para otimizar a leitura do sinal. Ajuste a posição da tocha para coordenadas X, Y, Z, de modo que a tocha se alinhe com o centro dos cones e a vazão de nebulizadores na janela de controle de plasma.
Faça os ajustes necessários na janela de ajuste de óptica de íons para a fonte, detector e analisador. Uma vez que a leitura do sinal seja otimizada, clique em Parar na janela Magnet Scan, clique em Calibrar Magnet e selecione uma Baixa Resolução na janela pop-up. Clique em OK E abra o arquivo smc de calibração de massa para calibrar o ímã.
Clique em Salvar, Use para aplicar a calibração do ímã atual às análises. Ao medir amostras desconhecidas com uma enorme gama de concentrações, realize uma calibração do detector para comparar sinais de contagem de pulsos de íons em baixas concentrações com sinais de íons atenuados produzidos em concentrações mais altas. Inicie a análise da amostra clicando em Aquisição de Dados e clique em Configuração de método no menu suspenso.
Use um método existente fornecido pelo fabricante ou crie um método baseado nos elementos de interesse. Se necessário, ajuste o Modo de Análise, Tempo de Moradia, Atraso do Interruptor, Número de Varreduras e Ciclos, Resolução, Modo de Detecção e a Massa do Parque para configurações de defletor. Clique em Salvar para gravar as configurações do método.
Otimize os parâmetros para cada metal e isótipo. Na barra de menu, clique em Aquisição de Dados. Clique em Batch Run no menu suspenso.
Como alternativa, clique no ícone BATCH abaixo da barra de menu, importe os parâmetros do lote de uma planilha ou crie uma sequência na janela Batch Run. Digite o tipo de amostra, a posição do rack do autosampler, o tempo de transferência, o tempo de lavagem, as réplicas, o ID da amostra e o arquivo do método. Organize a execução do lote para soluções padrão para curva de calibração, seguido por um padrão de controle de qualidade e, em seguida, amostras desconhecidas.
Monitore a deriva do instrumento e a reprodutibilidade da amostra, incluindo um padrão de controle de qualidade de 0,5 partes por bilhão a cada 5 a 10 amostras. Estudos de absorção de tecidos foram realizados com exposições transmitidas pela água de cisplatina e um novo composto anticâneo baseado em rutênio PMC79. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de cisplatina.
0, 3,75, 7,5 15, 30 e 60 miligramas por litro de cisplatina. O acúmulo de platina no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS e o tecido do organismo continha respectivas doses de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 e 461,9 nanogramas por organismo. A eclosão retardada foi observada em todas as concentrações de cisplatina.
Pós-descorção, os acordes foram coletados e analisados para platina separadamente. Doses não letais de cisplatina utilizadas para estudos de descorção determinaram que 93 a 96% da dose total entregue de cisplatina haviam se acumulado no acorde, com a dose restante dentro do tecido larval. As larvas de zebrafish foram expostas a 0, 3,1, 6,2, 9,2 e 12,4 miligramas por litro de PMC79.
Essas concentrações foram analiticamente determinadas para conter 0, 0,17, 0,44, 0,66 e 0,76 miligramas por litro de rutênio. Ao contrário dessa cisplatina, o eclosão retardado não foi observado nas larvas expostas do PMC79. Os acordes não foram incluídos na análise de rutênio, pois naturalmente degradaram-se antes da coleta de larvas.
O metal maciço dentro dos tecidos larvais analisados em cada concentração foi de 0,19, 0,41 e 0,68 nanogramas de rutênio por larva. Qualquer um dos reagentes adicionados ao protocolo de exposição dá o potencial de interferências isobáricas. Quando possível, considere alternativas como resfriamento rápido em comparação com tricaine.
Este método permite quantificação de dose metálica para toxicidade, eficácia, experimentos a serem comparados entre vertebrados mais altos. Estávamos especialmente entusiasmados que nossa dose limiar estava dentro de uma ordem de magnitude dada aos pacientes.
