El método de aislamiento de ADN propuesto puede servir para estudiar la dinámica de la microbiota intestinal en modelos de ratón con enfermedades autoinmunes. Se propone un método más versátil, rentable y eficiente para obtener ADN de muestras fecales que son comparables a los kits disponibles comercialmente. Para comenzar, saque cada ratón individualmente de su jaula, recoja un pellet fecal directamente del ano y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que se procese.
Procese las muestras con pinzas, tubos y guantes estériles y limpios. Agregue un pellet congelado a un tubo de tapón de rosca de dos mililitros previamente pesado y registre el peso fecal en gramos, que debe estar entre 0.02 y 0.05 gramos por pellet fecal. Agregue al pellet una capa delgada de perlas de vidrio de 0.1 milímetros, 500 microlitros de tampón de lisis y 200 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 20%.
Bead batió el tubo durante cuatro minutos en un homogeneizador, seguido de tres a cinco minutos de vórtice. Centrifugar los tubos durante un corto tiempo para eliminar las burbujas y la espuma. Para extraer ADN de las muestras de microbiota, transfiera 350 microlitros de sobrenadante de muestra a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 mililitros, sin residuos.
Agregue 500 microlitros de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, en una proporción de 25: 24: 1, y vórtice durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera 180 microlitros de la fase acuosa superior a un nuevo tubo de tapa a presión de 1,5 mililitros. Añadir 180 microlitros de cloroformo, invertir y mezclar.
A partir de esto, transfiera 180 microlitros de la fase acuosa a un nuevo tubo de tapa a presión. En un gabinete de bioseguridad, agregue 180 microlitros de isopropanol frío y 36 microlitros de acetato de amonio molar. Invierta varias veces para mezclar y coloque el tubo en hielo durante 20 minutos.
Deseche el sobrenadante, seguido de lavar los pellets varias veces con 500 microlitros de etanol frío al 70%. Deseche el sobrenadante y seque al aire el tubo boca abajo sobre papel de seda durante 20 minutos, hasta que el pellet se aclare. Suspenda el pellet en 50 microlitros de agua de grado molecular y caliente el líquido a 37 grados centígrados durante 10 minutos para disolver completamente los gránulos de ADN grandes.
Después de calentar, centrifugar estos tubos a 3, 400 veces G durante un minuto para recuperar las gotas de condensación de la tapa. Mida la concentración y obtenga la relación 260/280 utilizando un espectrofotómetro. Una proporción para el ADN de buena calidad es generalmente entre 1,8 y dos.
Centrifugar las muestras preparadas a 600 veces G durante un minuto a temperatura ambiente, antes de congelar a menos 80 grados centígrados durante 24 horas. Luego, envíe 20 microlitros de muestras con concentraciones que van de uno a 50 nanogramos por microlitro al Laboratorio Nacional de Argonne para su secuenciación. La cepa de ratón que carece del receptor CX3CR1 tiene una composición de microbiota intestinal diferente en comparación con los ratones LMR/lpr de tipo salvaje, ratones MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, muestra diferencias significativas en ciertos géneros, relevantes para bacterias potencialmente patógenas como las del filo Proteobacteria.
Tenga cuidado con la contaminación de la muestra. Tiene que ser estéril. Además, es importante pipetear con precisión al transferir el sobrenadante en un tubo nuevo.
Este método es adecuado para análisis moleculares como PCR, digestión de enzimas de restricción o construcción de bibliotecas genómicas. En el lupus, probamos una fuerte relación entre la microbiota intestinal y la progresión del lupus.
