Este protocolo permite el análisis cualitativo y cuantitativo del metaboloma no dirigido basado en el control de calidad FDR que reduce eficazmente los falsos positivos de la identificación de metabolitos. Este flujo de trabajo integra XY-Meta que utiliza la estrategia target-decoy para evaluar FDR con mayor precisión para la identificación del metaboloma en el módulo de análisis cualitativo. Esta medida puede filtrar eficazmente los resultados falsos positivos de la identificación no dirigida del metaboloma, lo que mejora la solidez del descubrimiento de biomarcadores o moléculas clave.
Esperamos que los investigadores puedan comprender y dominar la estrategia de señuelo de objetivos para el control de FDR y deben tratar de ejecutar estrictamente esta canalización varias veces con los parámetros predeterminados del protocolo. Comience yendo a la página web de la base de datos GNPS y haga clic en Examinar conjuntos de datos. Busque la palabra clave en la columna de título y, a continuación, haga clic en el número de ID del conjunto de datos.
Descargue el conjunto de datos mediante FTP y guarde los datos sin procesar en la carpeta correspondiente. Para convertir el formato de los datos sin procesar, primero instale el software ProteoWizard. En la ruta de instalación de ProteoWizard, escriba msconvert.
exe, seguido de los parámetros específicos para convertir el formato de datos sin procesar al formato mzXML. De nuevo, usando msconvert. exe convierta estos datos al formato MGF y guárdelos en la carpeta MGF.
Para preparar la biblioteca espectral de referencia para los metabolitos, vaya a la página web de GNPS. Busque la palabra clave NIST, haga clic en ver para obtener los detalles y descargue la biblioteca. Guarde la biblioteca en la carpeta de base de datos.
Descargue el programa XY-Meta. Busque el archivo de configuración de parámetros en la carpeta de configuración y cambie su contenido como se describe en el protocolo de texto. Establezca el tipo de aductos como una lista en la carpeta aducto.
Realice la identificación de metabolitos y el control de velocidad de descubrimiento falso mediante el comando XY-Meta.exe. Descargue e instale el paquete de software metaX. A continuación, edite la lista de muestras.
txt para especificar el ejemplo y sus correspondientes datos de espectrometría de masas como se describe en el protocolo de texto. Utilice el archivo R proporcionado con el protocolo de texto para ejecutar el script para la cuantificación de grupos Mock y de tipo salvaje utilizando el software metaX. Compruebe la carpeta de salida en la que se almacenan los resultados del análisis cuantitativo, como el gráfico PCA.
A continuación, modifique los parámetros en el script R para anotar los picos en el análisis cualitativo y cuantitativo utilizando identificaciones de metabolitos para integrar tanto los resultados como ejecutar el script R. Los diagramas de caja de metabolitos cuantificados mostraron que la distribución general de las muestras sanas y de enfermedad fue similar con una baja fluctuación de los valores medios. Sólo el 3,39% de los metabolitos tenían más del 30% de los valores faltantes.
La gráfica de análisis de componentes principales de las muestras de ambos grupos mostró que metaX aumentó notablemente la proporción de metabolitos con CV inferior a 0,3. Un diagrama de Venn de metabolitos detectados diferencialmente a partir de tres métodos de prueba estadísticos reveló 119 metabolitos comunes. El tiempo de retención y la distribución de masa por carga de todos los metabolitos anotados se trazaron con una tasa de descubrimiento falso de menos de 0,01, mostrando seis metabolitos significativos y detectados diferencialmente.
Es importante limitar el tiempo para las pruebas de flujo de trabajo. Recuerde, no seleccionar demasiadas muestras para el análisis y mantener al menos dos muestras en cada grupo. Esta técnica permite el control de calidad de la identificación metabolizada a partir de datos de adquisición independientes de los datos construyendo una biblioteca espectral de espectro de referencia más robusta utilizando los resultados de coincidencia de espectro basados en el control FDR.
