Este método permitirá al investigador sondear sistemas difíciles de estudiar, como péptidos e iones de metales de transición de primera fila, los cuales generalmente son desafiantes utilizando aplicaciones más estándar. La principal ventaja aquí es el uso de técnicas ortogonales porque se complementan bien, y eso puede dar más información sobre el sistema y ayudarnos a no perdernos ningún fenómeno. El método detallado en este video es muy adecuado para estudiar otros sistemas.
Aunque lo mostramos con Cu (II) y un péptido, se puede usar para muchas interacciones diferentes de péptidos metálicos y proteínas metálicas. Creo que la parte más difícil será encontrar una buena opción de tampón para su ion metálico y péptido. Consultaría la literatura para ver qué búferes han sido utilizados por otros antes.
demostrando el procedimiento estará Sohee Choi, una estudiante graduada en mi laboratorio de investigación. Para comenzar, encienda el espectrofotómetro electrónico de absorción y deje que se caliente durante aproximadamente 15 a 20 minutos antes de usarlo. Luego inicie el software del espectrofotómetro y configure los parámetros, como el rango de escaneo de 200 a 900 nanómetros, el rango de escaneo de 200 nanómetros por segundo y la línea de base de doble haz corregida.
A continuación, recoja una línea de base sin cubetas ni muestras en las trayectorias del haz. Usando dos cubetas emparejadas en el espectrofotómetro de doble haz, cargue una cubeta con 115 microlitros de agua ultrapura y la otra cubeta con 115 microlitros de la muestra de péptido, asegurándose de que no haya burbujas de aire en las cubetas, ya que interferirán con la señal. Después, coloque la cubeta con agua ultrapura en la viga de referencia y la cubeta con péptido en la viga de muestra.
Luego recoja el espectro de absorción del péptido libre de metal. Agregue una cantidad subestequiométrica de la solución de Cu (II) en la cubeta con la muestra de péptido y registre el volumen para su análisis posterior. Canalice suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución evitando la generación de burbujas de aire.
Después de equilibrar durante cinco minutos, vuelva a colocar la cubeta en el soporte de la celda de muestra y registre el espectro de absorción. Luego repita la adición de Cu(II)alícuotas en la solución peptídica para varios equivalentes y registre el volumen total de Cu(II)añadido a la cubeta. Después de inicializar el software como se describió anteriormente, en dos cubetas emparejadas, cargue una cubeta con 115 microlitros de agua ultrapura y otra cubeta con 115 microlitros de la solución compleja cobre-fen.
Coloque la cubeta con agua en la viga de referencia y la cubeta con solución compleja de cobre-phen en la viga de muestra. Luego recolecte el espectro de absorción del complejo de ligando metálico. Después, agregue una cantidad estequiométrica de péptido a la solución compleja de cobre-phen y canalice suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien mientras tiene cuidado de no introducir burbujas de aire.
A continuación, incubar la solución durante cinco minutos para alcanzar el equilibrio. Vuelva a colocar la cubeta en el soporte de la celda de muestra y registre el espectro de absorción. Más tarde, repita la adición de alícuotas peptídicas en la solución compleja de cobre-phen para varios equivalentes, y registre el volumen de péptido agregado para que se pueda determinar la concentración diluida.
Primero encienda el ITC e inicie el software ITC para ejecutar el instrumento. Después de la primera inicialización, vuelva a colocar la bureta y siga las instrucciones en pantalla. A continuación, retire la bureta y la cubierta de la celda de referencia.
A continuación, retire el agua de la celda de referencia y enjuague tres veces con 450 microlitros de agua ultra pura desgasificada. Extraiga lentamente agua ultrapura hasta la marca de 450 microlitros de una jeringa de carga teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la jeringa. Luego inserte la jeringa de carga en la celda de referencia hasta que esté aproximadamente a un milímetro del fondo e inyecte lentamente parte de la solución hasta que queden 150 microlitros en la jeringa de carga.
Después, mueva el émbolo de la jeringa de carga rápidamente hacia arriba y hacia abajo en aproximadamente 25 microlitros varias veces para desalojar cualquier burbuja en la superficie de la célula. Luego inyecte lentamente hasta que el émbolo alcance la marca de 100 microlitros en la jeringa de carga, dispensando así un total de 350 microlitros de agua ultrapura en la celda de referencia y reemplace la cubierta de la celda de referencia. Después de extraer cualquier solución residual de la celda de muestra, cargue 450 microlitros de EDTA 10 milimolares con una jeringa de carga y remoje durante 10 minutos para asegurarse de que se eliminen los iones de metales traza porque el EDTA se unirá a los metales traza.
Después de retirar la solución de EDTA, enjuague bien la jeringa de carga con grandes cantidades de agua ultrapura. Limpie el ITC de acuerdo con las instrucciones del fabricante enjuagando la celda de muestra con agua ultrapura. Retire cualquier agua residual de la celda de muestra y luego acondicione la celda de muestra enjuagando con 450 microlitros de tampón al menos tres veces.
A continuación, retire el tampón residual que está acondicionando la celda de muestra y cargue la solución peptídica en la celda de muestra utilizando la jeringa de carga. A continuación, enjuague la jeringa de valoración con 200 microlitros de la solución tamponada retirando primero el émbolo. Con una micropipeta, pipetear la solución tampón a través del orificio en la parte superior de la jeringa de valoración de vidrio a través de la jeringa y fuera de la aguja debajo.
Más tarde, inserte completamente el émbolo en la jeringa de titulación. A continuación, sumerja la punta de la aguja de la jeringa de valoración en la solución metálica y tire lentamente del émbolo hacia arriba, lo que hace que la solución metálica llene la jeringa y dé como resultado un volumen vacío en la parte superior de la parte de vidrio de la jeringa de valoración. Para eliminar el volumen vacío, gire la jeringa de valoración paralela al suelo.
Luego retire el émbolo e incline ligeramente la parte de vidrio hacia el piso. Agite suavemente la jeringa de valoración para que la solución se mueva a la parte de vidrio de la jeringa de valoración y llene la mayor parte del volumen vacío. Pero asegúrese de que queden de dos a tres microlitros de volumen vacío.
Mientras mantiene la jeringa paralela al suelo, vuelva a insertar el émbolo. Luego sostenga la jeringa de valoración en posición vertical y sumerja la punta de la aguja nuevamente en la solución metálica. A continuación, empuje el émbolo hacia abajo hasta que el aire deje de salir de la aguja y cargue la jeringa de valoración tirando lentamente del émbolo justo por encima de la marca de 50 microlitros mientras mantiene la punta de la aguja en la solución.
Inserte con cuidado la parte de vidrio de la jeringa de valoración en la bureta y atornille hasta que quede apretado el dedo. Después, con un limpiaparabrisas delicado de servicio ligero, absorbe la solución que sale de la jeringa de valoración debido a la compresión del émbolo sin tocar la punta de la aguja. A continuación, inserte la bureta con una jeringa de valoración en la celda de muestra y fíjela de forma segura.
Para configurar los parámetros del software ITC, seleccione el Control del instrumento. Ajuste la velocidad de agitación y la temperatura. Luego, en Detalles del experimento, ingrese las concentraciones de jeringa y celda en unidades milimolares.
A continuación, en la sección Método de experimento, seleccione Valoración incremental. Haga clic en Configuración y especifique 20 inyecciones de 2,5 microlitros y, si se requiere más resolución para observar el evento de unión, aumente el número de inyecciones y disminuya el volumen por inyección. Después, ingrese el espacio de tiempo entre cada inyección para que sea lo suficientemente largo como para que la señal se equilibre y regrese a la línea de base, generalmente 300 segundos.
A continuación, haga clic en el botón Ejecutar para iniciar el experimento y especificar dónde se guardan los datos. La titulación de Cu(II) se realizó en C-Peptide demostrando que la adición de 150 micromolares de Cu(II) causó un aumento inmediato en la banda a 600 nanómetros atribuida a la banda d-d de Cu(II) y continuó aumentando hasta que se añadieron 300 milimolares Cu(II). La adición adicional por encima de 300 Cu (II) micromolares no aumentó la absorción de la prohibición d-d que indica saturación y que Cu (II) se une al péptido C en un complejo 1: 1 con un valor log K de más de seis.
El péptido C se tituló en aproximadamente 10 micromolares del complejo cobre-phen y la absorción de la banda de transferencia de carga a 265 nanómetros disminuyó, lo que indica que el péptido C fue capaz de quelar Cu (II) del ligando fenantrolina con un valor log K de 7.4 a 7.8. El termograma ITC muestra la titulación de 1,4 milimolares Cu(II) en 154 micromolares C-péptido en 15 milimolares MOPS buffer. Se encontró que la afinidad de unión tenía un valor log K de ocho con un cambio en la entalpía de 8 kilojulios por mol.
Gibbs energía libre como menos 46 kilojulios por mol, y cambio en entropía como 120 julios por mol por kelvin. Una titulación controlada de 1,4 milimolares Cu(II) en tampón MOPS 15 milimolares en ausencia de péptido C no muestra unión en el termograma. Yo diría que asegurarse de que todo esté limpio.
Si hay iones metálicos o péptidos sobrantes de experimentos anteriores, puede afectar drásticamente la estequiometría y proporcionar una competencia desconocida en los experimentos de unión. El dicroísmo circular es otro método para estudiar las interacciones entre péptidos metálicos o proteínas metálicas porque analiza la quiralidad. La espectrometría de masas también puede interrogar estos complejos al observar los cambios en la masa.
Este conjunto de técnicas ha sido utilizado por muchos laboratorios que estudian iones metálicos que interactúan con péptidos o proteínas.
