El modelo TMEV es una de las primeras plataformas experimentales que permite la investigación de los mecanismos de desarrollo de convulsiones como consecuencia de la infección del SNC. Las infecciones del SNC aumentan significativamente el riesgo de epilepsia. Este modelo ayuda a identificar posibles objetivos terapéuticos y compuestos para pacientes en riesgo.
Los experimentadores deben ser entrenados para trabajar con ratones. La inyección del virus se puede practicar muy bien inyectando tinte en animales muertos para lograr suficiente precisión y rutina. Demostrando el procedimiento estará Laura Bell, una estudiante graduada de mi laboratorio.
Para comenzar, retire la tapa de la jeringa de insulina y agregue un tubo de polietileno como collar alrededor de la aguja para garantizar una profundidad de inyección adecuada de 2,5 milímetros. Luego sumerja la jeringa en etanol durante 30 minutos y coloque la jeringa bajo luz UV durante 30 minutos. A continuación, vuelva a colocar la tapa en la aguja y envuelva la jeringa en una bolsa esterilizante.
Pegue la bolsa con cinta adhesiva para cerrarla y etiquétela con la fecha de preparación. Para realizar la inyección de virus, obtenga alícuotas de la cepa Daniels de TMEV del congelador de menos 80 grados centígrados. Descongele el virus y manténgalo en hielo.
Luego cargue la jeringa con la suspensión del virus. Después, limpie el banco con desinfectante y trabaje bajo un absorbedor de humos. Transfiera el ratón anestesiado de la caja de anestesia debajo de la capucha y verifique la tolerancia quirúrgica realizando un pellizco en el dedo del pie.
Luego limpie la cabeza del animal con una almohadilla de alcohol e incline la cabeza del mouse ligeramente hacia la izquierda para que el sitio de inyección apunte hacia arriba. Tire de la piel un poco hacia atrás e inserte la aguja en la cabeza. A continuación, inyecte 20 microlitros intracordialmente a una profundidad de 2,5 milímetros en la región temporal del hemisferio derecho.
Deje la jeringa en su lugar durante cinco a 15 segundos y verifique si hay alguna fuga de la inyección o si se observan burbujas de aire, luego prepare una jeringa nueva. Cuando saque con cuidado la jeringa, gírela ligeramente. Luego transfiera al animal a una nueva jaula, que se coloca mitad en, mitad fuera de una almohadilla térmica durante la recuperación de la anestesia.
Y no deje a los animales desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Primero, lleve todas las jaulas al banco y observe a los animales para detectar convulsiones dos veces al día durante la fase de luz. Califique la actividad convulsiva mediante una escala de carreras modificada e informe el número y la intensidad de las convulsiones.
A continuación, deslice un bolígrafo a través de la jaula para hacer un poco de ruido y transfiera cada animal a otra caja y viceversa. Para los animales que no se han agarrado espontáneamente o después de una suave sacudida de la jaula, desencadene las convulsiones mediante un manejo más intenso mientras gira cuidadosamente el ratón volteándolo en su cola de izquierda a derecha. Observe a cada animal para detectar el comportamiento convulsivo nuevamente y repita el proceso para las jaulas posteriores.
Las convulsiones conductuales se registraron si ocurrieron durante las inyecciones de drogas o durante las sesiones posteriores de monitoreo del manejo de las convulsiones. Los datos observados se presentaron como un mapa de calor creado al representar las etapas de las convulsiones en diferentes colores. Al registrar el EEG, se pueden identificar varios eventos epilépticos en la fase crónica, meses después de la infección con TMEV.
La cuantificación de la degeneración del hipocampo y los ratones epilépticos infectados con TMEV muestra una disminución significativa en el área del hipocampo y un aumento correspondiente en el área ventricular de los ratones TMEV en comparación con los controles. El análisis inmunohistológico puede proporcionar información sobre diversos parámetros, como la presencia de células inflamatorias. En este caso, las secciones que contienen el hipocampo se tiñeron con anticuerpos para marcar los linfocitos T.
Los animales infectados simulados no muestran infiltración de células T, mientras que se observó una infiltración moderada en la mayoría de los ratones infectados con TMEV. Algunos de los ratones infectados muestran una infiltración severa de linfocitos T. No todos los animales tienen convulsiones durante cada período de observación.
Además, la mayor incidencia de convulsiones ocurre en los días cinco y seis después de la inoculación. Utilizamos el modelo TMEV para probar la eficacia de nuevos medicamentos anticonvulsivos contra las convulsiones inducidas por infecciones. También se pueden evaluar los ensayos que investigan los cambios de comportamiento comórbidos y los cambios electrofisiológicos.
El modelo TMEV ha proporcionado a la comunidad de investigación de la epilepsia el primer modelo de epilepsia del lóbulo temporal inducida por infección del SNC, lo que permite la investigación de los mecanismos subyacentes de la epileptogénesis después de la infección.
