Модель TMEV является одной из первых экспериментальных платформ, позволяющих исследовать механизмы развития судорог как следствия инфекции ЦНС. Инфекции ЦНС значительно увеличивают риск развития эпилепсии. Эта модель помогает идентифицировать потенциальные терапевтические мишени и соединения для пациентов из группы риска.
Экспериментаторы должны быть обучены работе с мышами. Инъекцию вируса можно очень хорошо практиковать, вводя краситель мертвым животным для достижения достаточной точности и рутины. Демонстрировать процедуру будет Лаура Белл, аспирантка из моей лаборатории.
Для начала снимите колпачок инсулинового шприца и добавьте полиэтиленовую трубку в качестве воротника вокруг иглы, чтобы обеспечить адекватную глубину инъекции 2,5 миллиметра. Затем погрузите шприц в этанол на 30 минут и поместите шприц под ультрафиолетовый свет на 30 минут. Затем наденьте колпачок обратно на иглу и заверните шприц в стерилизующий мешочек.
Заклейте пакет скотчем, чтобы закрыть его, и наклейте этикетку с датой приготовления. Чтобы выполнить инъекцию вируса, возьмите аликвоты штамма Дэниелса TMEV из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разморозьте вирус и держите его на льду.
Затем загрузите шприц с вирусной суспензией. После этого очистите скамейку дезинфицирующим средством и поработайте под поглотителем дыма. Перенесите анестезированную мышь из анестезиологического бокса под капюшоном и проверьте хирургическую переносимость, выполнив защемление пальца ноги.
Затем очистите голову животного спиртовой подушечкой и слегка наклоните голову мыши влево, чтобы место инъекции было направлено вверх. Оттяните кожу немного назад и введите иглу в головку. Далее вводят 20 микролитров внутрикордно на глубину 2,5 миллиметра в височную область правого полушария.
Оставьте шприц на месте на пять-15 секунд и проверьте, нет ли утечки из инъекции, или, если видны пузырьки воздуха, приготовьте новый шприц. Осторожно вытаскивая шприц, слегка поверните его. Затем пересаживают животное в новую клетку, в которую помещают наполовину наполовину, наполовину выключенную грелку во время восстановления после наркоза.
И не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Во-первых, поднесите все клетки к скамейке и наблюдайте за животными на предмет судорог два раза в день во время световой фазы. Оцените активность приступов по модифицированной гоночной шкале и сообщите количество и интенсивность приступов.
Затем проведите загоном по клетке, чтобы пошуметь, и перенесите каждое животное в другой ящик и обратно. Для животных, которые не схватились спонтанно или после легкого встряхивания клетки, вызывайте судороги более интенсивным обращением, осторожно переворачивая мышь, переворачивая ее хвостом слева направо. Понаблюдайте за каждым животным на предмет судорожного поведения еще раз и повторите процесс для последующих клеток.
Поведенческие припадки регистрировались, если они происходили во время инъекций наркотиков или во время последующих сеансов мониторинга обработки припадков. Наблюдаемые данные были представлены в виде тепловой карты, созданной путем изображения стадий припадка разными цветами. С помощью записи ЭЭГ можно выявить различные эпилептические явления в хронической фазе, через несколько месяцев после заражения ТМВ.
Количественная оценка дегенерации гиппокампа и эпилептических мышей, инфицированных TMEV, показывает значительное уменьшение площади гиппокампа и соответствующее увеличение площади желудочков мышей TMEV по сравнению с контрольной группой. Иммуногистологический анализ может предоставить информацию о различных параметрах, таких как наличие воспалительных клеток. В этом случае срезы, содержащие гиппокамп, окрашивали антителами для маркировки Т-лимфоцитов.
У фиктивно инфицированных животных инфильтрация Т-клеток отсутствовала, тогда как умеренная инфильтрация наблюдалась у большинства мышей, инфицированных TMEV. У некоторых инфицированных мышей наблюдается тяжелая инфильтрация Т-лимфоцитов. Не у всех животных случаются судороги в течение каждого периода наблюдения.
Кроме того, самая высокая частота судорог приходится на пятый и шестой день после прививки. Мы используем модель TMEV для проверки эффективности новых противосудорожных препаратов против судорог, вызванных инфекцией. Анализы, исследующие коморбидные поведенческие изменения и электрофизиологические изменения, также могут быть оценены.
Модель TMEV предоставила сообществу исследователей эпилепсии первую модель височной эпилепсии, вызванную инфекцией ЦНС, что позволило исследовать основные механизмы эпилептогенеза после заражения.
