Das TMEV-Modell ist eine der ersten experimentellen Plattformen, die es ermöglicht, die Mechanismen der Anfallsentwicklung als Folge einer ZNS-Infektion zu untersuchen. ZNS-Infektionen erhöhen das Risiko für Epilepsie erheblich. Diese Modelle helfen bei der Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele und Wirkstoffe für Risikopatienten.
Experimentatoren sollten in der Arbeit mit Mäusen geschult werden. Die Virusinjektion kann sehr gut geübt werden, indem Farbstoff in tote Tiere injiziert wird, um eine ausreichende Präzision und Routine zu erreichen. Das Verfahren wird von Laura Bell, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.
Entfernen Sie zunächst die Kappe der Insulinspritze und legen Sie einen Polyethylenschlauch als Kragen um die Nadel, um eine ausreichende Injektionstiefe von 2,5 Millimetern zu gewährleisten. Tauchen Sie die Spritze dann 30 Minuten lang in Ethanol und halten Sie die Spritze 30 Minuten lang unter UV-Licht. Setzen Sie dann die Kappe wieder auf die Nadel und wickeln Sie die Spritze in einen Sterilisationsbeutel.
Kleben Sie den Beutel mit Klebeband zu, um ihn zu verschließen, und beschriften Sie ihn mit dem Zubereitungsdatum. Um eine Virusinjektion durchzuführen, holen Sie sich Aliquoten des Daniels-Stammes von TMEV aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie das Virus auf und bewahren Sie es auf Eis auf.
Füllen Sie dann die Spritze mit der Virussuspension. Reinigen Sie anschließend die Bank mit Desinfektionsmittel und arbeiten Sie unter einem Rauchabsorber. Übertragen Sie die betäubte Maus aus der Anästhesiebox unter die Haube und überprüfen Sie die chirurgische Verträglichkeit, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen.
Reinigen Sie dann den Kopf des Tieres mit einem Alkoholpad und neigen Sie den Kopf der Maus leicht nach links, so dass die Injektionsstelle nach oben zeigt. Ziehen Sie die Haut etwas nach hinten und führen Sie die Nadel in den Kopf ein. Als nächstes injizieren Sie 20 Mikroliter intrakordial bis zu einer Tiefe von 2,5 Millimetern in den Schläfenbereich der rechten Hemisphäre.
Lassen Sie die Spritze fünf bis 15 Sekunden lang an Ort und Stelle und prüfen Sie, ob die Injektion undicht ist oder ob Luftblasen zu sehen sind, und bereiten Sie dann eine neue Spritze vor. Wenn Sie die Spritze vorsichtig herausziehen, drehen Sie sie leicht. Setzen Sie das Tier dann in einen neuen Käfig, der während der Genesung von der Narkose halb auf, halb von einem Heizkissen platziert wird.
Und lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein zu halten. Bringen Sie zunächst alle Käfige auf die Bank und beobachten Sie die Tiere zweimal täglich während der Lichtphase auf Krampfanfälle. Bewerten Sie die Anfallsaktivität anhand einer modifizierten Rennskala und geben Sie die Anzahl und Intensität der Anfälle an.
Schieben Sie als Nächstes einen Stift über den Käfig, um etwas Lärm zu machen, und bringen Sie jedes Tier in eine andere Box und zurück. Bei Tieren, die nicht spontan oder nach leichtem Käfigschütteln zugegriffen haben, lösen Sie Anfälle durch intensivere Handhabung aus, während Sie die Maus vorsichtig umdrehen, indem Sie sie am Schwanz von links nach rechts drehen. Beobachten Sie jedes Tier erneut auf das Anfallsverhalten und wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Käfige.
Verhaltensanfälle wurden aufgezeichnet, wenn sie während der Drogeninjektion oder während der anschließenden Überwachungssitzungen zur Anfallsbehandlung auftraten. Die beobachteten Daten wurden als Heatmap dargestellt, die durch die Darstellung der Anfallsstadien in verschiedenen Farben erstellt wurde. Durch die EEG-Aufzeichnung können verschiedene epileptische Ereignisse in der chronischen Phase, Monate nach der Infektion mit TMEV, identifiziert werden.
Die Quantifizierung der Hippocampus-Degeneration und der epileptischen TMEV-infizierten Mäuse zeigt eine signifikante Abnahme der Hippocampus-Fläche und eine entsprechende Zunahme der ventrikulären Fläche von TMEV-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Die immunhistologische Analyse kann Informationen über verschiedene Parameter wie das Vorhandensein von Entzündungszellen liefern. In diesem Fall wurden Schnitte, die den Hippocampus enthielten, mit Antikörpern gefärbt, um T-Lymphozyten zu markieren.
Scheininfizierte Tiere zeigten keine T-Zell-Infiltration, wohingegen bei der Mehrzahl der TMEV-infizierten Mäuse eine moderate Infiltration beobachtet wurde. Einige der infizierten Mäuse zeigen eine starke Infiltration von T-Lymphozyten. Nicht alle Tiere haben in jedem Beobachtungszeitraum Krampfanfälle.
Auch die höchste Inzidenz von Krampfanfällen tritt am fünften und sechsten Tag nach der Impfung auf. Wir verwenden das TMEV-Modell, um die Wirksamkeit neuartiger Anti-Krampf-Medikamente gegen infektionsinduzierte Anfälle zu testen. Assays, die komorbide Verhaltensänderungen und elektrophysiologische Veränderungen untersuchen, können ebenfalls ausgewertet werden.
Das TMEV-Modell hat der Epilepsieforschung das erste ZNS-infektionsinduzierte Modell der Temporallappenepilepsie zur Verfügung gestellt, das die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Epileptogenese nach einer Infektion ermöglicht.
