Este método puede ayudar a estudiar las direcciones de las proteínas con membranas lipídicas. En nuestro caso, utilícelo para analizar la unión dependiente del calcio de las anexoínas a los fosfolípidos cargados negativamente. Las principales ventajas de esta técnica son que es libre de etiquetas, sensible, cuantitativa, y que las interacciones se pueden observar en tiempo real.
Permitiendo así el análisis directo de resultados reales. Esta técnica también se puede aplicar a otros sistemas, como la interacción de conjuntos de micromoléculas más complejos o incluso celdas. Utilice soluciones claras de cinco lípidos militrolares como se describe en el protocolo de texto.
Combine los lípidos disueltos en la proporción molar deseada en tubos de vidrio de 10 mililitros. Evaporar los disolventes orgánicos utilizando una corriente seca de nitrógeno. Deje la mezcla de lípidos en un sistema de liofilización de alto vacío durante tres horas para eliminar cualquier rastro residual de los disolventes.
Ahora, resuspender la película de lípidos en un mililitro de tampón de citrato. Incubar la suspensión de lípidos a 60 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua, vórticándolo vigorosamente cada cinco minutos. Esta temperatura es de alrededor de 10 grados Celsius por encima de la temperatura de transición de fase del lípido de fusión más alto en la mezcla.
Mientras tanto, precalentar el extrusor equipado con una membrana de policarbonato de 50 nanómetros de diámetro poro por encima de la temperatura de transición durante 30 minutos. Cargue la suspensión de vesícula multilamelar en el extrusor precalentado. Pase suavemente la mezcla 31 veces a través de la membrana de policarbonato para formar pequeñas vesículas unilamelares o SUVs.
Mantenga la temperatura por encima de la temperatura de transición. Transfiera la suspensión SUV a un recipiente de reacción de plástico de dos mililitros y añada el tampón de citrato para llevar el volumen final a dos mililitros. Incubar cuatro sensores insertados en un soporte de politetrafluoroetileno en una solución 2%SDS durante al menos 30 minutos.
A continuación, lavarlos extensamente con agua ultra pura para eliminar por completo el SDS y probarlos utilizando una corriente de argón seco o nitrógeno. Utilice un sistema de limpieza por plasma para eliminar por completo cualquier contaminante. Para ello, inserte los sensores secos en la cámara de limpieza de plasma, evacúe la cámara y eléjela tres veces con oxígeno.
A continuación, encienda el limpiador de plasma. Utilice vacío, alta potencia de radiofrecuencia y 10 minutos de tiempo de proceso. Después de la limpieza, apague la máquina y saque los sensores.
Acose cuidadosamente los sensores de plasma limpiado en las cuatro cámaras de flujo utilizando pinzas. Evite cualquier presión o torsión de las cámaras y tubos que puedan causar fugas. Enjuague el sistema con búfer de citrato en el modo de flujo abierto durante 10 minutos.
Inicie el programa. Comience a registrar cualquier cambio en la frecuencia y la disipación del primer tono fundamental y los matices utilizando el software hasta que las líneas de base de frecuencia y disipación sean estables. Cuando las líneas base sean estables, aplique la suspensión SUV en el tampón de citrato.
Con un recipiente de reacción, retire 1,5 mililitros del volumen muerto y, a continuación, cierre el sistema en el modo de flujo de bucle. Registre el cambio de disipación de frecuencia durante otros 10 minutos. Cuando el SLB es estable, equilibre el sistema con un tampón de funcionamiento a las concentraciones de calcio requeridas en un modo de flujo abierto durante 40 minutos.
Agregue la proteína al tampón de funcionamiento que contiene calcio. Realice la aplicación de la proteína en un modo de flujo de bucle hasta que se alcance un estado estable de equilibrio. Ahora, disociar la proteína unida quelando iones de calcio con cinco EGTA milimétricas en el tampón de funcionamiento en modo de flujo abierto.
Regenere el sistema de microbalance con 50 mililitros de agua doble destilada en un modo de flujo abierto continuo. Retire los tubos del recipiente de agua y deje que el sistema se seque. Retire cuidadosamente el sensor de cristal y límpielo con una solución 2%SDS utilizando el soporte de politetrafluoroetileno.
Seque las partes visibles del interior del módulo de flujo donde se colocó el sensor. Aquí se muestra la grabación de la curva de frecuencia y los cambios de disipación. La caída prominente en la frecuencia sobre la adición de los liposomas, indica su absorción porque las vesículas llenas de tampón no son rígidas sino viscoelásticas, la disipación aumenta.
Posteriormente, las vesículas coalestes se rompen. La liberación concomitante del tampón dentro de las vesículas disminuye la masa adsorbida hasta que se alcanza una meseta estable. La unión del Anexo A2 a los lípidos añade masa como se ve en el claro cambio de frecuencia, pero no interfiere con la estructura bicaplada como se indica por el único pequeño cambio en la disipación.
Cuando el agente quelante elimina el iones de calcio, EGTA, Annexin A2 se disocia de la película lipídica. La frecuencia y las grabaciones de disipación cambian a los niveles observados con la bicaplaz que sólo indican que la unión del Anexo A2 depende totalmente del ion de calcio y que la película lipídica permanece intacta. Aquí se muestra un experimento representativo de control negativo.
Cuando la fosfatidilserina está ausente, no hay cambios en la frecuencia o la disipación son evidentes después de la adición de La anexo A2 en presencia del ion de calcio. Al intentar este procedimiento, es importante asegurar la formación adecuada de la bicacapa. Utilice los liposomas inmediatamente, de lo contrario las vesículas pequeñas se fusionarán en las más grandes con menos tensión superficial que puede conducir a una línea de base inestable.
Después de este procedimiento, se puede realizar una descripción cuantitativa de una interacción de proteína de membrana con el fin de responder a preguntas adicionales como la unión cooperativa versus no cooperativa.
