El protocolo presenta cómo la combinación de TEM de células líquidas e iluminación de luz se puede utilizar para observar los cambios estructurales en las bacterias encapsuladas con fotosensibilizador en la iluminación de la luz. La principal ventaja de esta técnica es su sencillez. El protocolo no requiere una preparación difícil de la muestra y proporciona suficiente encapsulación de bacterias con solución fotosensibilizadora.
Para comenzar, modifique el microscopio electrónico de transmisión conectando la fibra óptica a la columna del microscopio en la parte superior de la lente del objetivo. Permita unos pocos centímetros de espacio entre la lente del objetivo y la lente del condensador, además de una ranura libre para accesorios. Coloque dos rejillas TEM sin tratar cubiertas con carbono amorfo entre dos pinzas cruzadas, mirando hacia el lado recubierto de carbono hacia la parte superior.
Mantenga las rejillas lo más cerca posible del borde. Ponga cuatro microlitros de solución de bacterias en una de las rejillas. La densidad óptica de la muestra debe estar en el rango de cinco a 10.
Espere 60 segundos y seque cuidadosamente el líquido con papel de filtro. Trate de esparcir el líquido por toda la superficie de la rejilla durante el proceso. Coloque cuatro microlitros de fotosensibilizador en la misma rejilla.
Después de cinco segundos, borre el líquido. Deje una capa muy delgada de líquido sobre el sustrato. Coloque rápidamente la rejilla seca encima de la cubierta con líquido.
Mueva suavemente la rejilla superior al borde de la segunda y apriete los sustratos en los bordes con pinzas. Repita cuidadosamente el apretón. Deje la celda líquida entre las pinzas durante un minuto.
Inserte la muestra en el soporte TEM justo después de terminar la preparación. Después de insertar la muestra en el microscopio, comience las observaciones en modo de bajo aumento para encontrar un área de observación adecuada. Durante las observaciones, mantenga la dosis de electrones lo más baja posible.
Amplíe el tiempo de exposición. Encuentre las celdas rodeadas de líquido con el aumento apropiado con un tiempo de exposición prolongado y capture la primera imagen de inmediato. Mantenga constante la dosis de electrones y recopile imágenes cada 30 segundos para observar los cambios.
Examine cuidadosamente las imágenes y calcule la dosis total de electrones que corresponde a los primeros cambios visibles en las células. Antes de comenzar el experimento, ajuste la intensidad de la luz láser ajustando el valor actual. Inserte la muestra en el microscopio y encuentre el área de observación.
Capture la primera imagen de la célula antes de comenzar la iluminación de la muestra, y use la manta del haz para apagar el haz de electrones para evitar los efectos de la irradiación de electrones. Encienda el láser. Comience con un tiempo de iluminación corto, ya que la luz láser tiene una intensidad relativamente alta.
Después de ese tiempo, apague la fuente de luz. Apague la manta del haz y capture la imagen inmediatamente. Si es posible, utilice un algoritmo automático para exponer la muestra sólo durante el tiempo necesario para tomar la imagen.
Mida cuidadosamente el tiempo de irradiación de electrones para calcular la dosis de electrones utilizada para obtener imágenes. Se observa una notable degradación de la capa externa de la célula causada por las especies reactivas de oxígeno generadas por la radiación más ligera del fotosensibilizador después de un minuto. Una mayor iluminación de la luz hizo que los cambios fueran más visibles.
Los puntos de observación adecuados con suficiente líquido se pueden encontrar fácilmente a bajo aumento, ya que estas áreas aparecen más oscuras y borrosas. Las bacterias cubiertas de líquido son menos visibles que las secas, pero aún se pueden distinguir. Es útil observar el límite del líquido durante la imagen, y su movimiento se puede detectar fácilmente, lo que implica que el área elegida puede ser inadecuada e inestable.
Otro problema durante las observaciones es la evaporación del agua y la precipitación de la solución que puede ocurrir en áreas aleatorias de la muestra, incluidas las áreas que rodean a las bacterias. La encapsulación de bacterias también se puede realizar utilizando membranas de grafeno y nitrato de silicio. La preparación de la muestra es más difícil, pero la estabilidad de la celda líquida será mejor.
El método presentado se puede utilizar para observaciones de reacciones inducidas por la luz en líquido. Por ejemplo, la influencia de la luz en materiales metálicos, catalizadores inducidos por la luz y reacciones fotoquímicas.
