Este protocolo está diseñado para verificar si un compuesto candidato contra el VHB inhibe la entrada viral, especialmente mediante el bloqueo de la unión a NTCP. Esta técnica está destinada a investigar si la entrada del VHB o un paso inicial de infección podría ser interrumpido por cualquier compuesto candidato. Demostrando el procedimiento estará Piyanoot Thongsri, un estudiante de PSP de mi laboratorio.
Para comenzar la medición del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, o NTCP, incubar los hepatocitos maduros con ocho molinos o más de ácido etilendiaminotetraacético o EDTA durante 15 minutos. Recoja los gránulos celulares y fije los hepatocitos agregando 300 microlitros de paraformaldehído al 3,7% en PBS durante 15 minutos. Luego transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para centrifugarlos a 300 G y 25 grados centígrados durante 10 minutos.
Lave las células dos veces usando 700 microlitros de PBS que contienen 1% de suero bovino fetal o FBS en centrífuga durante 10 minutos como se describió anteriormente. Luego permeabilizar las células con 300 microlitros de 0.05% Triton X 100 en PBS a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la centrifugación dar tres lavados de un minuto cada uno utilizando 700 microlitros de PBS que contienen 1% FBS.
Incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con el anticuerpo primario contra NTCP en una proporción de uno a 100, seguido de tres lavados con tampón de lavado permanente y centrifugación. Tiñe las células con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y repite tres lavados de tampón de lavado permanente durante un minuto cada uno. Después de la centrifugación a 300 G, resuspender el pellet celular con 200 microlitros de PBS que contengan 1% de FBS.
En el software, seleccione los parámetros de medición para el análisis citométrico de flujo, incluidos FSC, SSC, FITC o PE. Establezca el ajuste de compensación automática e incluya los controles de compensación como se explica en el manuscrito. A continuación, ejecute la muestra sin teñir con un caudal fluídico medio de 60 microlitros por minuto. Ajuste el umbral de dispersión directa y lateral hasta que cubran la población de celdas de interés.
Marque la región de la puerta en esta área y aplíquela a todos los controles de compensación. Ajuste el tubo multiplicador de fotos o la fluorescencia PMT utilizando el control sin teñir y ajuste el voltaje PMT de FITC o PE en el cuadrante negativo. Ejecute la muestra teñida positiva y ajuste FITC o PE en la escala del cuadrante positivo.
Ejecute los controles sin teñir, teñidos FITC o PE, calcule la compensación y aplíquela a la configuración de la muestra. A continuación, ejecute la muestra de hepatocitos para medir el nivel de NTCP. A continuación, comience a analizar los hepatocitos teñidos seleccionando en serie en las ventanas de BD FACSuite, el tubo de control y luego la pestaña de fuentes de datos.
Espere a que aparezcan los datos sin procesar. A continuación, en la pestaña de la hoja de trabajo en el lado derecho, haga clic en el botón de puerta de elipse, seleccione la población de celdas y SSC y el diagrama de puntos FSC usando el cursor del mouse. A continuación, espere a que aparezca el círculo P1.
Haga clic en el botón de puerta de intervalo y marque la región en el histograma teñido de isotiocianato de fluoresceína. Comenzando desde el valor de intensidad de fluorescencia más alto hacia el lado derecho. La línea P2 aparece en la pantalla.
Haga clic en el tubo de experimento y observe que los datos en la pestaña de la hoja de trabajo cambian. Haga clic en el botón de estadísticas y luego en el espacio vacío y la hoja de trabajo. Luego, observe los valores estadísticos de la población de polipéptidos cotransportadores de taurocolato de sodio.
Aspirar el medio de las placas de pocillos MHC 100% confluentes y añadir cuatro ciclosporina A micromolar diluida con medio E de William durante dos horas. A continuación, aspire el candidato inhibidor de entrada del virus de la hepatitis B para reemplazarlo con un mililitro de Williams E Medium que contenga 4% de polietilenglicol. Luego, incubar el medio de cultivo con partículas del virus de la hepatitis B a una multiplicidad de infección de 100 por pocillo durante 18 horas a 37 grados centígrados.
Luego, deseche el sobrenadante a dos mililitros de PBS frío y agite suavemente para enjuagar el medio viejo con el virus de la hepatitis B no unido. Después de cultivar las células con dos mililitros de medio E de William completo durante siete días, lave las células con PBS y fíjelas con aldehído paraformado al 3,7% y PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Incubar secuencialmente las células infectadas con solución bloqueadora de FI durante 60 minutos a temperatura ambiente en el anticuerpo primario a una dilución de uno a 200 en la solución de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados.
Luego dé tres lavados de un minuto cada uno usando solución de lavado antes de incubar las células con el anticuerpo secundario en una dilución de uno a 500 durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces, monte la muestra con un medio de montaje anti decoloración con DAPI y cúbrala con un cubrero de vidrio. Usando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros DAPI y PE detecta la señal de fluorescencia con una lente objetivo 20 x para determinar la actividad de entrada anti HBV de los compuestos candidatos.
Para el ensayo de unión celular, prepare las células como se demostró antes e incubarlas con partículas del virus de la hepatitis B a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después de desechar el medio, enjuague las celdas con dos mililitros de PBS frío con un suave remolino. Luego cosecha las células infectadas usando un raspador celular e interrumpe las células con tampón de lisis.
Transfiera el lisado celular a un tubo de recolección para extraer el ADN total con reacción en cadena de la polimerasa utilizando las condiciones de temperatura descritas en el manuscrito. Después de preparar las células como se demostró anteriormente, incubar los hepatocitos con la solución de ácido taurocólico sódico durante 15 minutos a temperatura ambiente, aspirar la solución y lavar las células tres veces con HEPES fríos. A continuación, agregue de 300 a 500 microlitros de HEPES frío para cosechar las células con raspadores de células en hielo.
Homogeneizar las células por ultrasonido a 20 kilohercios durante 20 segundos e incubar en hielo durante cinco minutos. Después de la centrifugación a 10, 000 G, recoger el sobrenadante y evaluar la concentración intracelular de ácido taurocólico utilizando un kit de ensayo ELISA de ácido taurocólico. Para lavar las células y la jeringa en la calorimetría de titulación isotérmica o instrumento ITC, inicie el software ITC.
En la pestaña de resaltado ejecutar experimento, seleccione el método micro cal para ITCM de 19 puntos de inyección y haga clic en abrir. Cuando se abra una nueva ventana, haga clic en la pestaña de limpieza y en la ventana del método de limpieza seleccione el botón de lavado para el método de limpieza de celdas y el botón de enjuague para el método de limpieza de jeringas. Haga clic en siguiente y siga las instrucciones en pantalla.
Después de cargar la muestra en el ITC, haga clic en el botón de carga presente en la pestaña ejecutar experimento. Luego haga clic en siguiente y siga las instrucciones del video hasta que se complete este paso de carga. Con una jeringa, llene la celda de referencia con tampón de solución en la celda de muestra con 15 NTCP micromolares en el tampón.
Retire el exceso de solución, luego llene la jeringa con una solución de ligando de curcumina micromolar 150, evitando burbujas de aire. Ejecute el ejemplo haciendo clic en el botón Ejecutar en la pestaña Ejecutar experimento. La información experimental y la configuración se mostrarán en el lado izquierdo.
Introduzca las concentraciones de proteína del ligando y los detalles de temperatura. Haga clic en iniciar para realizar el proceso de inyección. Espere 1,4 horas para que se complete la interacción del ligando proteico.
Una vez completada la inyección, seleccione el botón de análisis resaltado para analizar los datos sin procesar utilizando el software de análisis. Luego, haga clic en descripción general para mostrar los datos sin procesar y elija el modelo de ajuste como un conjunto de sitio de enlace. Se observaron características de maduración hepática incluyendo células binucleadas y morfología de forma poligonal, especialmente en la etapa diferenciada del MHC.
Se observó un gran aumento en la expresión de NTCP en HepaRG diferenciado y MHC diferenciado. La forma altamente glicosilada de NTCP se detectó más en MHC diferenciado que en HepaRG diferenciada. Los niveles de NTCP fueron más altos en las células MHC diferenciadas que en las células indiferenciadas.
La tinción de inmunofluorescencia del virus evaluó las actividades de entrada anti VHB en el séptimo día después de la infección y el nivel de unión del virus en el receptor de la superficie celular se evaluó mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. El análisis de captación de ácido taurocólico sugirió que la actividad inhibitoria punitiva de los compuestos candidatos disminuyó la unión del virus de la hepatitis B a través de NTCP. La alteración colorimétrica se detectó con inyecciones continuas en la célula de muestra.
Se trazó una regresión estándar no lineal de mínimos cuadrados basada en un sitio de unión bien ajustado a los datos. La línea continua indicó el mejor ajuste a los valores experimentales para la unión de SBB como a y que las células y la partícula viral de la hepatitis B se incuban a cuatro grados centígrados. La actualización de ácido taurocólico se puede evaluar mediante la técnica radiactiva.
El nivel de ácido taurocólico radiactivo se puede cuantificar utilizando un contador de simulación líquida. Esta técnica es simple y rápida de detectar la entrada viral en la actividad de investigación de cualquier régimen antiviral que ayudaría a prevenir la infección o la reinfección.
