Этот протокол предназначен для проверки того, ингибирует ли потенциальное соединение против HBV проникновение вируса, особенно путем блокирования связывания NTCP. Этот метод предназначен для изучения того, может ли вход HBV или начальная стадия инфекции быть прерваны любым соединением-кандидатом. Продемонстрировать процедуру будет Пиянут Тхонгсри, студент PSP из моей лаборатории.
Чтобы начать измерение таурохолата натрия, котрансферирующего полипептида, или NTCP, инкубируют зрелые гепатоциты восьмимиллионной или более этилендиаминететрауксусной кислотой или ЭДТА в течение 15 минут. Соберите клеточные гранулы и зафиксируйте гепатоциты, добавив 300 микролитров 3,7% параформальдегида в PBS в течение 15 минут. Затем переложите клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, чтобы центрифугировать их при 300 G и 25 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Промыть клетки дважды, используя 700 микролитров PBS, содержащих 1% фетальной бычьей сыворотки или FBS в центрифуге в течение 10 минут, как описано ранее. Затем пронизывают клетки 300 микролитрами 0,05% Тритона Х 100 в PBS при комнатной температуре в течение 20 минут. После центрифугирования дают три промывки по одной минуте каждая, используя 700 микролитров PBS, содержащих 1% FBS.
Инкубируют клетки в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия с первичным антителом против NTCP в соотношении один к 100, после чего следуют три промывки с буфером промывки завивки и центрифугирование. Окрашивают клетки вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и повторяют три промывки промывочного буфера завивки по одной минуте каждая. После центрифугирования при 300 Г повторно суспендируют ячейку гранулы 200 микролитрами PBS, содержащими 1% FBS.
В программном обеспечении выберите параметры измерения для проточного цитометрического анализа, включая FSC, SSC, FITC или PE. Установите автоматическую настройку компенсации и включите элементы управления компенсацией, как описано в рукописи. Затем запустите незапятнанный образец со средней скоростью потока жидкости 60 микролитров в минуту. Отрегулируйте порог прямого рассеяния и бокового рассеяния до тех пор, пока они не охватят интересующую популяцию клеток.
Отметьте область ворот в этой области и примените ко всем элементам компенсационного контроля. Установите трубку множителя фотографий или флуоресценцию PMT с помощью незапятнанного элемента управления и отрегулируйте напряжение PMT FITC или PE в отрицательном квадранте. Запустите положительный окрашенный образец и отрегулируйте FITC или PE по шкале положительного квадранта.
Запустите неиспорченные, окрашенные FITC или PE элементы управления, рассчитайте компенсацию и примените ее к настройкам образца. Затем запустите образец гепатоцитов для измерения уровня NTCP. Затем начните анализ окрашенных гепатоцитов, последовательно выбирая окна BD FACSuite, контрольную трубку, а затем вкладку источников данных.
Дождитесь появления необработанных данных. Далее на вкладке листа справа нажмите на кнопку эллипсного затвора, выделите заполнение ячеек и SSC и точечный график FSC с помощью курсора мыши. Затем подождите, пока появится круг P1.
Нажмите на кнопку интервального затвора и отметьте область в гистограмме, окрашенной флуоресцеином изотиоцианатом. Начиная с самого высокого значения интенсивности флуоресценции с правой стороны. На экране появится строка P2.
Щелкните трубку эксперимента и обратите внимание, что данные на вкладке листа изменяются. Нажмите на кнопку статистики, а затем на пустое место и лист. Затем понаблюдайте за статистическими значениями популяции таурохолата натрия, котрансдирующего полипептид.
Аспирируйте среду из 100% сливающихся пластин скважин MHC и добавьте четыре микромолярного циклоспорина А, разбавленного средой Уильяма E в течение двух часов. Затем аспирируйте потенциальный ингибитор проникновения вируса гепатита В, чтобы заменить его одним миллилитром среды Williams E, содержащей 4% полиэтиленгликоля. Затем инкубируют культуральную среду с частицами вируса гепатита В при кратности заражения 100 на лунку в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия.
Затем выбросьте супернатант на два миллилитра холодного PBS и осторожно закрутите, чтобы смыть старую среду с несвязанным вирусом гепатита В. После культивирования клеток двумя миллилитрами полной среды Уильяма E в течение семи дней промывайте клетки PBS и фиксируйте их 3,7% параформным альдегидом и PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Последовательно инкубируют инфицированные клетки блокирующим раствором ПЧ в течение 60 минут при комнатной температуре в первичном антителе при одном -200 разведении в блокирующем растворе на ночь при четырех градусах Цельсия.
Затем дать три промывки по одной минуте каждая с использованием моющего раствора перед инкубацией клеток с вторичным антителом в одном - 500 разведении в течение одного часа при комнатной температуре. После трижды промывки установите образец с помощью антивядающего монтажного носителя с DAPI и накройте его стеклянной крышкой. Использование флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами DAPI и PE, обнаруживает флуоресцентный сигнал с помощью объектива 20 x для определения анти-HBV входной активности соединений-кандидатов.
Для анализа связывания клеток подготовьте клетки, как было продемонстрировано ранее, и инкубируйте их с частицами вируса гепатита В при четырех градусах Цельсия в течение двух часов. После выбрасывания среды промойте клетки двумя миллилитрами холодного PBS с легким вихрем. Затем соберите инфицированные клетки с помощью клеточного скребка и разрушайте клетки с помощью буфера лизиса.
Перенесите лизат клетки в коллекторную трубку для извлечения общей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции с использованием температурных условий, описанных в рукописи. После подготовки клеток, как показано ранее, инкубируют гепатоциты раствором таурохолевой кислоты натрия в течение 15 минут при комнатной температуре, аспирируют раствор и трижды промывают клетки холодным HEPES. Затем добавьте от 300 до 500 микролитров холодного HEPES для сбора клеток со скребками на льду.
Гомогенизируют клетки ультразвуком при 20 килогерцах в течение 20 секунд и инкубируют на льду в течение пяти минут. После центрифугирования при 10 000 г собирают надосадочный агент и оценивают внутриклеточную концентрацию таурохолевой кислоты с помощью набора для анализа ИФА таурохолевой кислоты. Чтобы промыть ячейки и шприц в изотермической титрующей калориметрии или приборе ITC, запустите программное обеспечение ITC.
На вкладке «Выполнить эксперимент» выберите метод микрокала для 19 точек внедрения ITCM и нажмите кнопку «Открыть». Когда откроется новое окно, нажмите на вкладку очистки и в окне метод очистки выберите кнопку стирки для метода очистки клеток и кнопку промывки для метода очистки шприца. Нажмите «Далее» и следуйте инструкциям на экране.
После загрузки образца в ITC нажмите кнопку загрузки, присутствующую на вкладке «Запуск эксперимента». Затем нажмите «Далее» и следуйте инструкциям видео, пока этот шаг загрузки не будет завершен. Используя шприц, заполните эталонную ячейку буфером раствора в ячейке образца с 15 микромолярными NTCP в буфере.
Удалите лишний раствор, затем заполните шприц 150 микромоляльным раствором куркумина лиганда, избегая пузырьков воздуха. Запустите образец, нажав кнопку выполнить на вкладке запуск эксперимента. Экспериментальная информация и настройки будут отображаться с левой стороны.
Введите концентрацию белка лиганда и детали температуры. Нажмите кнопку Пуск, чтобы выполнить процесс инъекции. Подождите 1,4 часа, пока взаимодействие с белковым лигандом завершится.
После завершения внедрения выберите выделенную кнопку анализа, чтобы проанализировать необработанные данные с помощью программного обеспечения для анализа. Затем нажмите «Обзор», чтобы отобразить необработанные данные, и выберите модель подгонки в качестве одного набора сайта привязки. Наблюдались особенности созревания печени, включая бинуклеированные клетки и морфологию полигональной формы, особенно в дифференцированной стадии MHC.
Значительное увеличение экспрессии NTCP наблюдалось при дифференцированном HepaRG и дифференцированном MHC. Высокогликозилированная форма NTCP была обнаружена больше в дифференцированном MHC, чем в дифференцированном HepaRG. Уровни NTCP были выше в дифференцированных клетках MHC, чем в недифференцированных клетках.
Окрашивание иммунофлуоресценцией вируса оценивало активность входа против HBV на седьмой день после заражения, а уровень связывания вируса на рецепторе клеточной поверхности оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Анализ поглощения таурохолевой кислоты показал, что карательная ингибирующая активность соединений-кандидатов снижает связывание вируса гепатита В через NTCP. Колориметрическое изменение было обнаружено при непрерывных инъекциях в клетку образца.
Стандартная нелинейная регрессия наименьших квадратов была построена на основе одного сайта привязки, хорошо приспособленного к данным. Сплошная линия указала, что наиболее соответствует экспериментальным значениям для связывания SBB как a и что клетки и вирусные частицы гепатита B инкубируются при четырех градусах Цельсия. Обновление таурохолевой кислоты может быть оценено с помощью радиоактивной техники.
Уровень радиоактивной таурохолевой кислоты может быть количественно определен с помощью счетчика моделирования жидкости. Этот метод прост и быстр для скрининга на проникновение вируса в исследовательскую активность любого противовирусного режима, который поможет предотвратить инфекцию или повторное заражение.
