Dieses Protokoll wurde entwickelt, um zu überprüfen, ob ein Anti-HBV-Wirkstoffkandidat den viralen Eintritt hemmt, insbesondere durch Blockierung der NTCP-Bindung. Mit dieser Technik soll untersucht werden, ob der HBV-Eintritt oder ein erster Schritt der Infektion durch eine Kandidatenverbindung unterbrochen werden könnte. Piyanoot Thongsri, ein PSP-Student aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.
Um mit der Messung des Natriumtaurocholat-Co-Transport-Polypeptids oder NTCP zu beginnen, inkubieren Sie die reifen Hepatozyten mit acht Mill oder mehr Ethylendiamintetraessigsäure oder EDTA für 15 Minuten. Sammeln Sie Zellpellets und fixieren Sie die Hepatozyten, indem Sie 300 Mikroliter 3,7% Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten hinzufügen. Dann wird die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, um sie 10 Minuten lang bei 300 G und 25 Grad Celsius zu zentrifugieren.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit 700 Mikrolitern PBS mit 1% fetalem Rinderserum oder FBS in der Zentrifuge für 10 Minuten, wie zuvor beschrieben. Dann permeabilisieren Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern 0,05% Triton X 100 in PBS bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Nach der Zentrifugation drei Wäschen von jeweils einer Minute mit 700 Mikrolitern PBS mit 1% FBS geben.
Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper gegen NTCP im Verhältnis eins zu 100, gefolgt von drei Waschgängen mit Dauerwellenwaschpuffer und Zentrifugation. Färben Sie die Zellen mit einem sekundären Antikörper, der an Alexa Fluor 488 konjugiert ist, für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und wiederholen Sie drei Waschgänge Dauerwellen-Waschpuffer für jeweils eine Minute. Nach der Zentrifugation bei 300 G wird das Zellpellet mit 200 Mikrolitern PBS mit 1% FBS resuspendiert.
Wählen Sie in der Software die Messparameter für die durchflusszytometrische Analyse aus, einschließlich FSC, SSC, FITC oder PE. Stellen Sie die automatische Kompensationsanpassung ein und schließen Sie die Kompensationssteuerelemente ein, wie im Manuskript erläutert. Als nächstes führen Sie die ungefärbte Probe mit einer mittleren fluidischen Durchflussrate von 60 Mikrolitern pro Minute aus. Passen Sie den Vorwärtsstreu- und Seitenstreuschwellenwert an, bis sie die interessierende Zellpopulation abdecken.
Markieren Sie den Gate-Bereich in diesem Bereich und wenden Sie ihn für alle Kompensationskontrollen an. Stellen Sie die Photomultiplierröhre oder PMT-Fluoreszenz mit dem ungefärbten Regler ein und stellen Sie die PMT-Spannung von FITC oder PE im negativen Quadranten ein. Führen Sie die positiv gefärbte Probe aus und passen Sie FITC oder PE in der positiven Quadrantenskala an.
Führen Sie die Steuerelemente "Unstained", "FITC Stained" oder "PE" aus, berechnen Sie die Kompensation und wenden Sie sie auf die Probeneinstellungen an. Führen Sie als Nächstes das Hepatozytenbeispiel aus, um den NTCP-Pegel zu messen. Als nächstes beginnen Sie mit der Analyse der gefärbten Hepatozyten, indem Sie seriell auf BD FACSuite-Fenstern, dem Steuerrohr und dann auf der Registerkarte Datenquellen auswählen.
Warten Sie, bis die Rohdaten angezeigt werden. Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte Arbeitsblatt auf der rechten Seite auf die Schaltfläche Ellipsentor, wählen Sie die Zellpopulation und SSC und das FSC-Punktdiagramm mit dem Mauszeiger aus. Warten Sie dann, bis der Kreis P1 angezeigt wird.
Klicken Sie auf die Intervall-Gate-Schaltfläche und markieren Sie den Bereich im fluoreszierenden Isothiocyanat-Färbungshistogramm. Beginnend mit dem höchsten Fluoreszenzintensitätswert auf der rechten Seite. Die Zeile P2 wird auf dem Bildschirm angezeigt.
Klicken Sie auf das Experimentröhrchen und beobachten Sie, dass sich die Daten auf der Registerkarte Arbeitsblatt ändern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik und dann auf den leeren Bereich und das Arbeitsblatt. Beobachten Sie dann die statistischen Werte der Natriumtaurocholat-mittransportierenden Polypeptidpopulation.
Saugen Sie das Medium aus den 100% konfluenten MHC-Well-Platten ab und fügen Sie vier mikromolare Ciclosporin A hinzu, verdünnt mit William's E Medium für zwei Stunden. Als nächstes saugen Sie den Kandidaten für den Eintritt des Hepatitis-B-Virus ab, um ihn durch einen Milliliter Williams E-Medium zu ersetzen, der 4% Polyethylenglykol enthält. Dann inkubieren Sie das Kulturmedium mit Hepatitis-B-Viruspartikeln bei einer Vielzahl von Infektionen von 100 pro Vertiefung für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius.
Dann verwerfen Sie den Überstand bei zwei Milliliter kaltem PBS und schwenken Sie vorsichtig, um das alte Medium mit ungebundenem Hepatitis-B-Virus abzuspülen. Nach sieben Tagen Kultivierung der Zellen mit zwei Milliliter komplettem William's E Medium waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie sie mit 3,7% paraformem Aldehyd und PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die infizierten Zellen nacheinander mit IF-Blockierlösung für 60 Minuten bei Raumtemperatur im primären Antikörper bei einer bis 200 Verdünnung in der Blockierlösung über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Dann geben Sie drei Wäschen von jeweils einer Minute mit Waschlösung, bevor Sie die Zellen mit dem sekundären Antikörper in einer bis 500 Verdünnung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem dreimaligen Waschen montieren Sie die Probe mit einem Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI und decken Sie sie mit einem Glasdeckel ab. Mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit DAPI- und PE-Filtern ausgestattet ist, wird das Fluoreszenzsignal mit einer 20-fach-Objektivlinse detektiert, um die Anti-HBV-Eintrittsaktivität der Kandidatenverbindungen zu bestimmen.
Für den Zellbindungstest bereiten Sie die Zellen wie zuvor demonstriert vor und inkubieren sie zwei Stunden lang mit Hepatitis-B-Viruspartikeln bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das Medium verworfen haben, spülen Sie die Zellen mit zwei Milliliter kaltem PBS mit einem sanften Schwenk ab. Dann ernten Sie die infizierten Zellen mit einem Zellschaber und stören Sie die Zellen mit Lysepuffer.
Übertragen Sie das Zelllysat in ein Sammelröhrchen, um die gesamte DNA mit Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der im Manuskript beschriebenen Temperaturbedingungen zu extrahieren. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor demonstriert vorbereitet haben, inkubieren Sie die Hepatozyten mit der Natriumtaurocholsäurelösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur, saugen Sie die Lösung ab und waschen Sie die Zellen dreimal mit kaltem HEPES. Als nächstes fügen Sie 300 bis 500 Mikroliter kaltes HEPES hinzu, um die Zellen mit Zellschaber auf Eis zu ernten.
Homogenisieren Sie die Zellen durch Ultraschall bei 20 Kilohertz für 20 Sekunden und inkubieren Sie fünf Minuten auf Eis. Nach der Zentrifugation bei 10.000 G wird der Überstand gesammelt und die intrazelluläre Taurocholsäurekonzentration mit einem Taurocholsäure-ELISA-Assay-Kit bewertet. Um die Zellen und die Spritze in der isothermen Titrationskalorimetrie oder dem ITC-Instrument zu waschen, starten Sie die ITC-Software.
Wählen Sie auf der Registerkarte Highlight Run Experiment die Option Micro Cal-Methode für 19 Injektionspunkte ITCM aus, und klicken Sie auf Öffnen. Wenn sich ein neues Fenster öffnet, klicken Sie auf die Registerkarte Reinigen und wählen Sie im Fenster Reinigungsmethode die Schaltfläche Waschen für die Reinigungsmethode und die Schaltfläche für die Spritzenreinigungsmethode aus. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.
Nachdem Sie das Beispiel in die ITC geladen haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Laden unter der Registerkarte Experiment ausführen. Klicken Sie dann auf Weiter und folgen Sie den Videoanweisungen, bis dieser Ladeschritt abgeschlossen ist. Füllen Sie die Referenzzelle mit einer Spritze mit Lösungspuffer in der Probenzelle mit 15 mikromolaren NTCP im Puffer.
Entfernen Sie die überschüssige Lösung und füllen Sie die Spritze mit einer 150 Mikromolaren Curcumin-Ligandenlösung, um Luftblasen zu vermeiden. Führen Sie das Beispiel aus, indem Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Die experimentellen Informationen und Einstellungen werden auf der linken Seite angezeigt.
Geben Sie die Ligandenproteinkonzentrationen und Temperaturdetails ein. Klicken Sie auf Start, um den Injektionsvorgang durchzuführen. Warten Sie 1,4 Stunden, bis die Proteinligandeninteraktion abgeschlossen ist.
Sobald die Injektion abgeschlossen ist, wählen Sie die markierte Analyseschaltfläche, um die Rohdaten mit der Analysesoftware zu analysieren. Klicken Sie dann auf Übersicht, um die Rohdaten anzuzeigen, und wählen Sie das Anpassungsmodell als einen Satz von Bindungsstellen aus. Leberreifungsmerkmale wurden beobachtet, einschließlich zweikerniger Zellen und polygonal geformter Morphologie, insbesondere im differenzierten Stadium von MHC.
Ein starker Anstieg der NTCP-Expression wurde in differenziertem HepaRG und differenziertem MHC beobachtet. Die stark glykosylierte Form von NTCP wurde stärker in differenziertem MHC als in differenziertem HepaRG nachgewiesen. Die NTCP-Spiegel waren in differenzierten MHC-Zellen höher als in den undifferenzierten Zellen.
Die Immunfluoreszenzfärbung des Virus bewertete die Anti-HBV-Eintrittsaktivitäten am siebten Tag nach der Infektion und das Niveau der Virusbindung am Zelloberflächenrezeptor wurde durch Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion bewertet. Die Analyse der Aufnahme von Taurocholsäure deutete darauf hin, dass die strafende hemmende Aktivität der Kandidatenverbindungen die Hepatitis-B-Virusbindung durch NTCP verringerte. Die kolorimetrische Veränderung wurde durch kontinuierliche Injektionen in die Probenzelle nachgewiesen.
Eine standardmäßige nichtlineare Regression der kleinsten Quadrate wurde basierend auf einer Bindungsstelle aufgetragen, die gut an die Daten angepasst war. Die durchgezogene Linie zeigte die beste Übereinstimmung mit den experimentellen Werten für die SBB-Bindung als a und dass Zellen und Hepatitis-B-Viruspartikel bei vier Grad Celsius inkubiert werden. Taurocholsäure-Update kann mit der radioaktiven Technik ausgewertet werden.
Der Gehalt an radioaktiver Taurocholsäure kann mit einem Flüssigkeitssimulationszähler quantifiziert werden. Diese Technik ist einfach und schnell auf virale Eingaben in die Untersuchungsaktivität eines antiviralen Regimes zu untersuchen, das helfen würde, entweder eine Infektion oder eine erneute Infektion zu verhindern.
