Este protocolo é projetado para verificar se um composto anti-HBV candidato inibe a entrada viral, especialmente bloqueando a ligação NTCP. Esta técnica destina-se a investigar se a entrada de HBV ou uma etapa inicial de infecção pode ser interrompida por qualquer composto candidato. A demonstrar o procedimento estará Piyanoot Thongsri, um estudante da PSP do meu laboratório.
Para iniciar a medição do polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio, ou NTCP, incube os hepatócitos maduros com oito moinhos ou mais de ácido etilenodiaminotetracético ou EDTA por 15 minutos. Coletar pellets celulares e fixar os hepatócitos adicionando 300 microlitros de paraformaldeído a 3,7% em PBS por 15 minutos. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para centrífuga a 300 G e 25 graus Celsius por 10 minutos.
Lave as células duas vezes usando 700 microlitros de PBS contendo 1% de soro fetal bovino ou FBS em centrífuga por 10 minutos, conforme descrito anteriormente. Em seguida, permeabilizar as células com 300 microlitros de 0,05%Triton X 100 em PBS à temperatura ambiente por 20 minutos. Após a centrifugação dê três lavagens de um minuto cada usando 700 microlitros de PBS contendo 1% FBS.
Incubar as células por 30 minutos a quatro graus Celsius com o anticorpo primário contra NTCP na proporção de um a 100, seguido de três lavagens com tampão de lavagem perm e centrifugação. Colorir as células com um anticorpo secundário conjugado ao Alexa Fluor 488 por 30 minutos a quatro graus Celsius e repetir três lavagens de tampão de lavagem perm por um minuto cada. Após centrifugação a 300 G, ressuscite o pellet celular com 200 microlitros de PBS contendo 1% de FBS.
No software, selecione os parâmetros de medição para análise citométrica de fluxo, incluindo FSC, SSC, FITC ou PE. Defina o ajuste de compensação automática e inclua os controles de compensação conforme explicado no manuscrito. Em seguida, execute a amostra não corada com uma taxa de fluxo fluídico médio de 60 microlitros por minuto. Ajuste a dispersão para a frente e o limiar de dispersão lateral até que cubram a população celular de interesse.
Marque a região do portão nesta área e aplique a todos os controles de compensação. Ajuste o tubo fotomultiplicador ou a fluorescência PMT usando o controle não corado e ajuste a tensão PMT do FITC ou PE no quadrante negativo. Execute a amostra corada positiva e ajuste o FITC ou PE na escala do quadrante positivo.
Execute os controles não manchados, FITC ou PE, calcule a compensação e aplique-a às configurações da amostra. Em seguida, execute a amostra de hepatócitos para medir o nível de NTCP. Em seguida, comece a analisar os hepatócitos corados selecionando em série as janelas BD FACSuite, o tubo de controle e, em seguida, a guia Fontes de dados.
Aguarde até que os dados brutos apareçam. Em seguida, na guia da planilha no lado direito, clique no botão da porta de elipse, selecione a população de células e o SSC e o gráfico de pontos FSC usando o cursor do mouse. Em seguida, aguarde até que o círculo P1 apareça.
Clique no botão de porta de intervalo e marque a região no histograma corado com isotiocianato de fluoresceína. A partir do maior valor de intensidade de fluorescência para o lado direito. A linha P2 aparece na tela.
Clique no tubo de experimento e observe que os dados na guia da planilha são alterados. Clique no botão de estatísticas e, em seguida, no espaço vazio e na planilha. Em seguida, observe os valores estatísticos da população de polipeptídeos co-transportadores de taurocolato de sódio.
Aspirar o meio das placas do poço MHC 100% confluente e adicionar quatro ciclosporina A micromolar diluída com o meio E de William por duas horas. Em seguida, aspirar o inibidor de entrada do vírus da hepatite B candidato para substituí-lo por um mililitro de meio Williams E contendo 4% de polietilenoglicol. Em seguida, incubar o meio de cultura com partículas do vírus da hepatite B a uma multiplicidade de infecção de 100 por poço por 18 horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, descarte o sobrenadante em dois mililitros de PBS frio e gire suavemente para enxaguar o meio antigo com o vírus da hepatite B não ligado. Após a cultura das células com dois mililitros de E Medium de William completo por sete dias, lave as células com PBS e fixe-as com aldeído 3,7% paraforme e PBS por 15 minutos à temperatura ambiente. Incubar sequencialmente as células infectadas com solução bloqueadora de FI durante 60 minutos à temperatura ambiente no anticorpo primário a uma diluição a 200 na solução bloqueadora durante a noite a quatro graus Celsius.
Em seguida, dê três lavagens de um minuto cada usando solução de lavagem antes de incubar as células com o anticorpo secundário em uma diluição a 500 por uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem três vezes, monte a amostra com um meio de montagem antidesbotamento com DAPI e cubra-a com uma folha de tampa de vidro. Usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros DAPI e PE, detecte o sinal de fluorescência com uma lente objetiva de 20 x para determinar a atividade de entrada anti-HBV dos compostos candidatos.
Para o ensaio de ligação celular, prepare as células como demonstrado anteriormente e incube-as com partículas do vírus da hepatite B a quatro graus Celsius por duas horas. Depois de descartar o meio, lave as células com dois mililitros de PBS frio com um redemoinho suave. Em seguida, colha as células infectadas usando um raspador de células e interrompa as células com tampão de lise.
Transfira o lisado celular para um tubo de coleta para extrair o DNA total com reação em cadeia da polimerase usando as condições de temperatura descritas no manuscrito. Depois de preparar as células como demonstrado anteriormente, incubar os hepatócitos com a solução de ácido taurocólico de sódio por 15 minutos à temperatura ambiente, aspirar a solução e lavar as células três vezes com HEPES frio. Em seguida, adicione 300 a 500 microlitros de HEPES frios para colher as células com raspadores de células no gelo.
Homogeneize as células por ultrassom a 20 kilohertz por 20 segundos e incube no gelo por cinco minutos. Após centrifugação a 10.000 G, coletar o sobrenadante e avaliar a concentração de ácido taurocólico intracelular usando um kit de ensaio ELISA de ácido taurocólico. Para lavar as células e seringas na calorimetria de titulação isotérmica ou instrumento ITC, inicie o software ITC.
Na guia de realce do experimento de execução, selecione o método micro cal para ITCM de 19 pontos de injeção e clique em abrir. Quando uma nova janela for aberta, clique na guia Limpar e, na janela Método de limpeza, selecione o botão de lavagem para o método de limpeza da célula e o botão de enxágue para o método de limpeza de seringas. Clique em Avançar e siga as instruções na tela.
Depois de carregar a amostra no ITC, clique no botão de carregamento presente na guia Executar experimento. Em seguida, clique em Avançar e siga as instruções em vídeo até que esta etapa de carregamento seja concluída. Usando uma seringa, encha a célula de referência com tampão de solução na célula da amostra com 15 NTCP micromolares no tampão.
Remova o excesso de solução e, em seguida, encha a seringa com uma solução de ligante de curcumina micromolar 150, evitando bolhas de ar. Execute o exemplo clicando no botão Executar na guia Executar experimento. As informações e configurações experimentais serão exibidas no lado esquerdo.
Insira as concentrações de proteína do ligante e os detalhes de temperatura. Clique em Iniciar para executar o processo de injeção. Aguarde 1,4 horas para que a interação do ligante proteico seja concluída.
Uma vez que a injeção esteja completa, selecione o botão de análise destacado para analisar os dados brutos usando o software de análise. Em seguida, clique em Visão geral para exibir os dados brutos e escolha o modelo de ajuste como um conjunto de site de vinculação. Características de maturação hepática foram observadas incluindo células binucleadas e morfologia em forma poligonal, especialmente no estágio diferenciado do MHC.
Um grande aumento na expressão de NTCP foi observado em HepaRG diferenciado e MHC diferenciado. A forma altamente glicosilada do NTCP foi detectada mais no MHC diferenciado do que no HepaRG diferenciado. Os níveis de NTCP foram maiores nas células MHC diferenciadas do que nas células indiferenciadas.
A coloração por imunofluorescência do vírus avaliou as atividades de entrada anti-HBV no sétimo dia pós-infecção e o nível de ligação do vírus no receptor da superfície celular foi avaliado por reação em cadeia da polimerase em tempo real. A análise de captação de ácido taurocólico sugeriu que a atividade inibitória punitiva dos compostos candidatos diminuiu a ligação do vírus da hepatite B através do NTCP. A alteração colorimétrica foi detectada com injeções contínuas na célula da amostra.
Uma regressão padrão de mínimos quadrados não lineares foi plotada com base em um local de ligação ajustado bem aos dados. A linha sólida indicou o melhor ajuste aos valores experimentais para a ligação SBB como a e que as células e a partícula viral da hepatite B são incubadas a quatro graus Celsius. A atualização do ácido taurocólico pode ser avaliada usando a técnica radioativa.
O nível de ácido taurocólico radioativo pode ser quantificado usando um contador de simulação líquida. Esta técnica é simples e rápida de rastrear a entrada viral na atividade de investigação de qualquer regime antiviral que ajude a prevenir a infecção ou a reinfecção.
