Estos protocolos están diseñados para comprender cómo los neutrófilos humanos interactúan y matan las biopelículas bacterianas. El objetivo es comprender mejor esto y limitar la variabilidad del ensayo al ensayo, entendiendo que existen problemas inherentes con los neutrófilos humanos de la variación del donante al donante. Las técnicas enumeradas aquí se han optimizado para permitir a los usuarios realizar experimentos con una variabilidad mínima, especialmente con biopelículas sueltas.
Además, estos protocolos también se pueden adaptar para estudiar otros microbios que pueden formar biopelículas. Comience por obtener colonias aisladas de Staphylococcus aureus de un stock criopreservado utilizando una técnica de placa de rayas en una placa de agar rica en nutrientes, como el agar de soja tríptico. Cubra los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de PLL diluidos en agua estéril e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Aspire la solución de PLL asépticamente usando una trampa de aspiración asistida por vacío. Deje que los pocillos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Preparar un cultivo nocturno inoculando una colonia de S.aureus en MEM-alfa suplementado con 2% de glucosa e incubado a 37 grados centígrados durante 16 a 18 horas a 200 rotaciones por minuto.
Diluir el cultivo durante la noche transfiriendo 50 microlitros a cinco mililitros de MEM-alfa fresco suplementado con 2% de glucosa. Luego incubarlo a 37 grados centígrados a 200 rotaciones por minuto hasta que se logre la fase logarítmica media. Utilice MEM-alfa para normalizar el cultivo logarítmico medio a un OD de 0,1.
Transfiera 150 microlitros de cultivo normalizado a cada pocillo de la placa de 96 pocillos tratada con PLL. Incubar la placa en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 18 a 20 horas. Aspirar el sobrenadante para eliminar las células planctónicas.
Lave suavemente la biomasa restante con 150 microlitros de HBSS para eliminar las células no unidas. Repita al menos dos veces para eliminar todas las células planctónicas. Agregue 100 microlitros de suero humano normal al 20% diluido en HBSS gota a gota al biofilm lavado e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos para opsonizar el biofilm.
Aspirar la solución de suero y lavar las biopelículas gota a gota con 150 microlitros de HBSS. Aspirar el HBSS, dejando atrás pozos con biofilms opsonizados. Agregue luminol a los neutrófilos resuspendidos en HBSS para formar una concentración final de cinco luminoles micromolares.
Esta solución está lista para usar para los grupos A y C.Agregue neutrófilos mezclados con luminol a los pocillos con biopelículas opsonizadas. Para el grupo D, prepare 50 solución de luminol micromolar en HBSS en un tubo separado sin neutrófilos y agréguela al pocillo que contiene la biopelícula. Alícuota 350 microlitros de neutrófilos mezclados con luminol y añadir PMA a una concentración final de 500 nanogramos por mililitro a la mezcla.
Para el grupo B, agregue los neutrófilos de esta mezcla en pocillos sin biopelícula. Esto sirve como un control positivo. Centrifugar la placa a 270 RCF durante 30 segundos a cuatro grados centígrados.
Asegúrese de que el lector de placas esté ajustado a 37 grados centígrados, la luminiscencia y la lectura cinética durante 60 minutos con intervalos de tres minutos. Coloque la placa en el lector de placas para medir la producción de ROS por los neutrófilos durante 60 minutos. Use una cepa fluorescente de S.aureus, como USA300, que exprese GFP para facilitar las imágenes de microscopía.
Incubar neutrófilos con 100 BCD micromolares durante 30 minutos en un balancín a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono atmosférico. Asegúrese de que las muestras se incuben en la oscuridad y limite la exposición a la luz. Para lavar el exceso de BCD, centrifugar los neutrófilos a 270 RCF durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante.
Vuelva a suspender los neutrófilos en HBSS fresco. Luego agregue ethidium homodimer-1 a los neutrófilos teñidos con BCD a una concentración final de cuatro micromolares para monitorear la muerte bacteriana y de neutrófilos. Lave la biopelícula con HBSS y agregue 150 microlitros de neutrófilos a la biopelícula de S.aureus que se ha cultivado en microdiapositivas.
Incubar los microportaobjetos en una cámara humidificada durante 30 minutos. El número de células bacterianas se basará en los recuentos celulares obtenidos del recubrimiento de biopelícula de 18 horas. Obtener una imagen de la interacción de la biopelícula de neutrófilos utilizando canales fluorescentes correspondientes a colorantes fluorescentes, o longitudes de onda de excitación y emisión de proteínas.
Los medios de crecimiento bacteriano minimizaron la viabilidad de los neutrófilos a aproximadamente un 60% después de 30 minutos de período de incubación. Los medios de cultivo de células de mamíferos, sin embargo, no afectaron la viabilidad de los neutrófilos, y también pueden apoyar el crecimiento de biopelículas de S.aureus. Los neutrófilos tratados con PMA utilizado como control mostraron un aumento de la producción de ROS.
En ausencia de biopelículas, los neutrófilos tratados con PMA mostraron una producción robusta de ROS. En presencia de biopelícula de S.aureus, la producción global de ROS por neutrófilos tratados con PMA disminuyó, mientras que en ausencia de PMA, los neutrófilos se basaron únicamente en su interacción con la biopelícula, reduciendo aún más la producción de ROS. La microscopía fluorescente de campo amplio reveló que muchos neutrófilos estaban localizados en la superficie, mientras que unos pocos estaban dentro de las biopelículas de S.aureus.
La mayoría de las células de S.aureus que interactúan con los neutrófilos estaban muertas, mientras que unas pocas permanecieron vivas según lo determinado por la tinción VIVA / MUERTA. Las biopelículas teñidas con Ethidium homodimer-1 revelaron una fracción de la población muerta de S.aureus dentro de la biopelícula. El efecto de lavar la biopelícula y los neutrófilos después de 30 minutos de incubación para eliminar los neutrófilos no adheridos reveló que alrededor del 33% de los neutrófilos muertos todavía estaban unidos a la biopelícula.
Los protocolos enumerados aquí también se pueden utilizar para estudiar más a fondo otras funcionalidades de los neutrófilos, como la fagocitosis y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos cuando los neutrófilos se encuentran con biopelículas.
