Esses protocolos são projetados para entender como os neutrófilos humanos interagem e matam os biofilmes bacterianos. O objetivo é entender melhor isso e limitar a variabilidade de ensaio para ensaio, entendendo que existem problemas inerentes aos neutrófilos humanos da variação de doador para doador. As técnicas listadas aqui foram otimizadas para permitir que os usuários realizem experimentos com variabilidade mínima, especialmente com biofilmes frouxamente ligados.
Além disso, esses protocolos também podem ser adaptados para estudar outros micróbios que podem formar biofilmes. Comece por obter colônias isoladas de Staphylococcus aureus de um caldo criopreservado usando uma técnica de placa de estria em uma placa de ágar rica em nutrientes, como o ágar tríptico de soja. Revestir poços individuais de uma placa de 96 poços com 100 microlitros de PLL diluídos em água estéril e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
Aspirar a solução PLL assepticamente utilizando um purgador de aspiração assistida por vácuo. Deixe os poços secarem durante a noite à temperatura ambiente. Preparar uma cultura noturna inoculando uma colônia de S.aureus em MEM-alfa suplementada com glicose a 2% e incubada a 37 graus Celsius por 16 a 18 horas a 200 rotações por minuto.
Diluir a cultura durante a noite transferindo 50 microlitros para cinco mililitros de MEM-alfa fresco suplementado com 2% de glicose. Em seguida, incube-o a 37 graus Celsius a 200 rotações por minuto até que a fase logarítmica média seja alcançada. Use MEM-alfa para normalizar a cultura logarítmica média para uma DO de 0,1.
Transfira 150 microlitros de cultura normalizada para cada poço da placa de 96 poços tratada com PLL. Incubar a placa em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 18 a 20 horas. Aspirar o sobrenadante para remover as células planctônicas.
Lave suavemente a biomassa restante com 150 microlitros de HBSS para remover as células não ligadas. Repita pelo menos duas vezes para remover todas as células planctônicas. Adicione 100 microlitros de soro humano 20% normal diluído em HBSS gota a gota ao biofilme lavado e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para opsonizar o biofilme.
Aspirar a solução sérica e lavar os biofilmes gota a gota com 150 microlitros de HBSS. Aspirar o HBSS, deixando para trás poços com biofilmes opsonizados. Adicionar luminol aos neutrófilos ressuspensos em HBSS para formar uma concentração final de cinco luminol micromolar.
Esta solução está pronta para uso nos grupos A e C.Adicione neutrófilos misturados com luminol aos poços com biofilmes opsonizados. Para o grupo D, preparar 50 solução de luminol micromolar em HBSS num tubo separado sem neutrófilos e adicioná-la ao poço que contém o biofilme. Aliquot 350 microlitros de neutrófilos misturados com luminol e adicionar PMA a uma concentração final de 500 nanogramas por mililitro à mistura.
Para o grupo B, adicione os neutrófilos desta mistura em poços sem biofilme. Isso serve como um controle positivo. Centrifugar a placa a 270 RCF durante 30 segundos a quatro graus Celsius.
Certifique-se de que o leitor de placas esteja ajustado para 37 graus Celsius, a luminescência e a leitura cinética por 60 minutos com intervalos de três minutos. Coloque a placa no leitor de placas para medir a produção de ROS por neutrófilos por 60 minutos. Use uma cepa fluorescente de S.aureus, como USA300, expressando GFP para facilitar a imagem da microscopia.
Incubar neutrófilos com BCD micromolar de 100 por 30 minutos em um balancim a 37 graus Celsius com dióxido de carbono atmosférico a 5%. Certifique-se de que as amostras estejam incubadas no escuro e limite a exposição à luz. Para lavar o excesso de BCD, centrifugar neutrófilos a 270 RCF por cinco minutos e aspirar o sobrenadante.
Ressuspender os neutrófilos no HBSS fresco. Em seguida, adicione o homodímero etídio-1 aos neutrófilos corados com BCD a uma concentração final de quatro micromolares para monitorar a morte de neutrófilos e bactérias. Lave o biofilme com HBSS e adicione 150 microlitros de neutrófilos ao biofilme S.aureus que foi cultivado em microlâminas.
Incubar as microlâminas em uma câmara umidificada por 30 minutos. O número de células bacterianas será baseado nas contagens celulares obtidas a partir do revestimento de biofilme de 18 horas. Fotografe a interação do biofilme de neutrófilos usando canais fluorescentes correspondentes a corantes fluorescentes, ou comprimentos de onda de excitação e emissão de proteínas.
Os meios de crescimento bacteriano minimizaram a viabilidade dos neutrófilos para aproximadamente 60% após 30 minutos do período de incubação. Os meios de cultura de células de mamíferos, no entanto, não afetaram a viabilidade dos neutrófilos e também podem apoiar o crescimento de biofilmes de S.aureus. Neutrófilos tratados com PMA utilizados como controle apresentaram aumento da produção de EROs.
Na ausência de biofilmes, os neutrófilos tratados com PMA apresentaram produção robusta de EROs. Na presença de biofilme de S.aureus, a produção global de EROs por neutrófilos tratados com PMA diminuiu, enquanto na ausência de PMA, os neutrófilos dependiam exclusivamente de sua interação com o biofilme, reduzindo ainda mais a produção de ROS. A microscopia fluorescente de campo largo revelou que muitos neutrófilos estavam localizados na superfície, enquanto alguns estavam dentro dos biofilmes de S.aureus.
A maioria das células de S.aureus que interagiam com neutrófilos estavam mortas, enquanto algumas permaneceram vivas, conforme determinado pela coloração VIVA/MORTA. Os biofilmes corados com homodímero 1 de Ethidium revelaram uma fração da população morta de S.aureus dentro do biofilme. O efeito da lavagem do biofilme e dos neutrófilos após 30 minutos de incubação para remover neutrófilos não aderidos revelou que cerca de 33% dos neutrófilos mortos ainda estavam ligados ao biofilme.
Os protocolos listados aqui também podem ser usados para estudar outras funcionalidades dos neutrófilos, como fagocitose e formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos quando os neutrófilos encontram biofilmes.
