Diese Protokolle sollen verstehen, wie menschliche Neutrophile mit bakteriellen Biofilmen interagieren und diese abtöten. Ziel ist es, dies besser zu verstehen und die Variabilität von Assay zu Assay zu begrenzen, wobei zu verstehen ist, dass es inhärente Probleme mit menschlichen Neutrophilen von Donor zu Donor Variation gibt. Die hier aufgeführten Techniken wurden optimiert, um den Anwendern Experimente mit minimaler Variabilität zu ermöglichen, insbesondere mit lose gebundenen Biofilmen.
Darüber hinaus können diese Protokolle auch angepasst werden, um andere Mikroben zu untersuchen, die Biofilme bilden können. Beginnen Sie mit der Gewinnung isolierter Kolonien von Staphylococcus aureus aus einem kryokonservierten Bestand unter Verwendung einer Streifenplattentechnik auf einer nährstoffreichen Agarplatte, wie z. B. tryptischem Sojaagar. Beschichten Sie einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern PLL, verdünnt in sterilem Wasser und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Die PLL-Lösung wird aseptisch mit einer vakuumunterstützten Aspirationsfalle abgesaugt. Lassen Sie die Brunnen über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Bereiten Sie eine Nachtkultur vor, indem Sie eine Kolonie von S.aureus in MEM-alpha impfen, die mit 2% Glukose ergänzt und bei 37 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert wird.
Verdünnen Sie die Übernachtkultur, indem Sie 50 Mikroliter auf fünf Milliliter frisches MEM-alpha mit 2% Glukose überführen. Dann inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis die mittlere logarithmische Phase erreicht ist. Verwenden Sie MEM-alpha, um die mittlere logarithmische Kultur auf einen OD von 0,1 zu normalisieren.
Übertragen Sie 150 Mikroliter normalisierte Kultur in jede Vertiefung der PLL-behandelten 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Stunden. Saugen Sie den Überstand ab, um die Planktonzellen zu entfernen.
Waschen Sie die restliche Biomasse vorsichtig mit 150 Mikrolitern HBSS, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie dies mindestens zweimal, um alle Planktonzellen zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter 20% normales menschliches Serum, das in HBSS verdünnt ist, tropfenweise in den gewaschenen Biofilm und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, um den Biofilm zu opsonisieren.
Die Serumlösung absaugen und die Biofilme mit 150 Mikrolitern HBSS tropfenweise waschen. Absaugen Sie das HBSS und hinterlassen Sie Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen. Fügen Sie Luminol zu den in HBSS resuspendierten Neutrophilen hinzu, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren Luminol zu bilden.
Diese Lösung ist gebrauchsfertig für die Gruppen A und C. Fügen Sie Neutrophile, die mit Luminol gemischt sind, in die Vertiefungen mit opsonisierten Biofilmen ein. Für Gruppe D werden 50 mikromolare Luminollösung in HBSS in einem separaten Röhrchen ohne Neutrophile hergestellt und in die Vertiefung gegeben, die den Biofilm enthält. Aliquot 350 Mikroliter Neutrophile mit Luminol gemischt und PMA in einer Endkonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter zu der Mischung hinzufügen.
Für Gruppe B geben Sie die Neutrophilen aus dieser Mischung in Vertiefungen ohne Biofilm. Dies dient als Positivkontrolle. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 RCF für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius.
Stellen Sie sicher, dass der Plattenleser auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, die Lumineszenz und kinetische Anzeige für 60 Minuten mit Drei-Minuten-Intervallen. Legen Sie die Platte in den Plattenleser, um die ROS-Produktion durch Neutrophile 60 Minuten lang zu messen. Verwenden Sie einen fluoreszierenden Stamm von S.aureus, wie USA300, der GFP exprimiert, um die mikroskopische Bildgebung zu erleichtern.
Inkubieren Sie Neutrophile mit 100 Mikromolar BCD für 30 Minuten in einer Wippe bei 37 Grad Celsius mit 5% atmosphärischem Kohlendioxid. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Dunkeln inkubiert werden, und begrenzen Sie die Lichteinwirkung. Um überschüssiges BCD zu waschen, zentrifugieren Sie Neutrophile bei 270 RCF für fünf Minuten und saugen Sie den Überstand ab.
Resuspendieren Sie die Neutrophilen in frischem HBSS. Dann fügen Sie Ethidiumhomodimer-1 zu den BCD-gefärbten Neutrophilen in einer Endkonzentration von vier Mikromolaren hinzu, um den Neutrophilen- und Bakterientod zu überwachen. Waschen Sie den Biofilm mit HBSS und fügen Sie dem S.aureus-Biofilm, der in Mikroobjektträgern gezüchtet wurde, 150 Mikroliter Neutrophile hinzu.
Inkubieren Sie die Mikroobjektträger in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten. Die Anzahl der Bakterienzellen basiert auf der Zellzahl, die aus der 18-stündigen Biofilmbeschichtung gewonnen wird. Stellen Sie sich die Wechselwirkung mit dem neutrophilen Biofilm unter Verwendung von Fluoreszenzkanälen vor, die Fluoreszenzfarbstoffen oder den Anregungs- und Emissionswellenlängen von Proteinen entsprechen.
Bakterielle Wachstumsmedien minimierten die Lebensfähigkeit von Neutrophilen nach 30 Minuten Inkubationszeit auf etwa 60%. Säugetierzellkulturmedien hatten jedoch keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Neutrophilen und können auch das Wachstum von S.aureus-Biofilmen unterstützen. Neutrophile, die mit PMA behandelt wurden, zeigten eine erhöhte ROS-Produktion.
In Abwesenheit von Biofilmen zeigten mit PMA behandelte Neutrophile eine robuste ROS-Produktion. In Gegenwart von S.aureus-Biofilm nahm die gesamte ROS-Produktion von Neutrophilen, die mit PMA behandelt wurden, ab, während Neutrophile in Abwesenheit von PMA ausschließlich auf ihre Interaktion mit dem Biofilm angewiesen waren, was die ROS-Produktion weiter reduzierte. Die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass viele Neutrophile auf der Oberfläche lokalisiert waren, während einige wenige in den S.aureus-Biofilmen lagen.
Die meisten S.aureus-Zellen, die mit Neutrophilen interagieren, waren tot, während einige am Leben blieben, wie durch LIVE/DEAD-Färbung bestimmt. Ethidium-homodimer-1-gefärbte Biofilme zeigten einen Bruchteil der toten S.aureus-Population innerhalb des Biofilms. Die Wirkung des Waschens des Biofilms und der Neutrophilen nach 30 Minuten Inkubation, um nicht haftende Neutrophile zu entfernen, zeigte, dass etwa 33% der toten Neutrophilen immer noch an den Biofilm gebunden waren.
Die hier aufgeführten Protokolle können auch verwendet werden, um andere Funktionalitäten von Neutrophilen, wie Phagozytose und Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen, wenn Neutrophile auf Biofilme treffen, weiter zu untersuchen.
