تم تصميم هذه البروتوكولات لفهم كيفية تفاعل العدلات البشرية مع الأغشية الحيوية البكتيرية وقتلها. الهدف هو فهم هذا بشكل أفضل ، والحد من التباين من الفحص إلى الفحص ، مع فهم أن هناك مشكلات متأصلة في العدلات البشرية من المانح إلى المانح. تم تحسين التقنيات المدرجة هنا للسماح للمستخدمين بإجراء تجارب بأقل قدر من التباين ، خاصة مع الأغشية الحيوية المرفقة بشكل فضفاض.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تكييف هذه البروتوكولات لدراسة الميكروبات الأخرى التي يمكن أن تشكل الأغشية الحيوية. ابدأ بالحصول على مستعمرات معزولة من المكورات العنقودية الذهبية من مخزون محفوظ بالتبريد باستخدام تقنية لوحة مخططة على صفيحة أجار غنية بالمغذيات ، مثل أجار الصويا التربتيكي. قم بتغطية الآبار الفردية للوحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من PLL المخفف في ماء معقم واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
قم بشفط محلول PLL بشكل معقم باستخدام مصيدة شفط بمساعدة الفراغ. اترك الآبار تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق تلقيح مستعمرة من S.aureus في MEM-alpha مكملة ب 2٪ جلوكوز وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة بمعدل 200 دورة في الدقيقة.
تمييع الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق نقل 50 ميكرولتر إلى خمسة ملليلتر من MEM-alpha الطازجة تستكمل مع 2 ٪ الجلوكوز. ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية بمعدل 200 دورة في الدقيقة حتى يتم تحقيق المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة. استخدم MEM-alpha لتطبيع الثقافة اللوغاريتمية المتوسطة إلى OD 0.1.
انقل 150 ميكرولترا من الثقافة الطبيعية إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا المعالجة ب PLL. احتضان اللوحة في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 20 ساعة. نضح الطاف لإزالة الخلايا العوالق.
اغسل الكتلة الحيوية المتبقية برفق باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS لإزالة الخلايا غير المرفقة. كرر مرتين على الأقل لإزالة جميع خلايا العوالق. أضف 100 ميكرولتر من مصل بشري طبيعي بنسبة 20٪ مخفف في HBSS بالتنقيط إلى الغشاء الحيوي المغسول واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لامتصاص الغشاء الحيوي.
استنشاق محلول المصل وغسل الأغشية الحيوية بالتنقيط باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS. نضح HBSS ، تاركا وراءه آبارا ذات أغشية حيوية أوبسونية. أضف اللومينول إلى العدلات المعاد تعليقها في HBSS لتكوين تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار لومينول.
هذا الحل جاهز للاستخدام للمجموعتين A و C.أضف العدلات الممزوجة باللومينول إلى الآبار مع الأغشية الحيوية الأوبسونية. بالنسبة للمجموعة D ، قم بإعداد 50 محلول لومينول ميكرومولار في HBSS في أنبوب منفصل بدون أي عدلات ، وأضفه إلى البئر الذي يحتوي على الغشاء الحيوي. حصة 350 ميكرولتر من العدلات الممزوجة مع اللومينول وإضافة PMA بتركيز نهائي قدره 500 نانوجرام لكل ملليلتر إلى الخليط.
بالنسبة للمجموعة (ب)، أضف العدلات من هذا الخليط إلى آبار بدون غشاء حيوي. هذا بمثابة السيطرة الإيجابية. جهاز طرد مركزي للوحة عند 270 RCF لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية.
تأكد من ضبط قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية ، وقراءة التلألؤ والحركية لمدة 60 دقيقة بفواصل زمنية مدتها ثلاث دقائق. ضع اللوحة في قارئ اللوحة لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات لمدة 60 دقيقة. استخدم سلالة فلورية من S.aureus ، مثل USA300 ، للتعبير عن GFP لتسهيل التصوير المجهري.
احتضان العدلات مع 100 micromolar BCD لمدة 30 دقيقة في الروك عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. تأكد من تحضين العينات في الظلام ، والحد من التعرض للضوء. لغسل BCD الزائد ، العدلات الطرد المركزي في 270 RCF لمدة خمس دقائق ، واستنشاق الطاف.
أعد تعليق العدلات في HBSS الطازجة. ثم أضف إيثيديوم هوموديمر-1 إلى العدلات الملطخة ب BCD بتركيز نهائي يبلغ أربعة ميكرومولار لمراقبة العدلات والموت البكتيري. اغسل الغشاء الحيوي الرقيق باستخدام HBSS وأضف 150 ميكرولترا من العدلات إلى الغشاء الحيوي S.aureus الذي نما في شرائح صغيرة.
احتضان الشرائح الصغيرة في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة. سيعتمد عدد الخلايا البكتيرية على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من طلاء الأغشية الحيوية لمدة 18 ساعة. تخيل تفاعل الأغشية الحيوية للعدلات باستخدام قنوات الفلورسنت المقابلة للأصباغ الفلورية ، أو الأطوال الموجية لإثارة البروتينات وانبعاثاتها.
قللت وسائط النمو البكتيري من صلاحية العدلات إلى حوالي 60٪ بعد 30 دقيقة من فترة الحضانة. ومع ذلك ، لم تؤثر وسائط زراعة خلايا الثدييات على صلاحية العدلات ، ويمكن أن تدعم أيضا نمو الأغشية الحيوية S.aureus. أظهرت العدلات المعالجة ب PMA المستخدمة كعنصر تحكم زيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية.
في غياب الأغشية الحيوية ، أظهرت العدلات المعالجة ب PMA إنتاجا قويا لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). في وجود S.aureus biofilm ، انخفض إجمالي إنتاج ROS بواسطة العدلات المعالجة ب PMA ، بينما في غياب PMA ، اعتمدت العدلات فقط على تفاعلها مع الغشاء الحيوي ، مما قلل من إنتاج ROS. كشف المجهر الفلوري واسع المجال أن العديد من العدلات كانت موضعية على السطح بينما كان القليل منها داخل الأغشية الحيوية S.aureus.
ماتت معظم خلايا S.aureus التي تتفاعل مع العدلات ، بينما بقي عدد قليل منها على قيد الحياة كما هو محدد من خلال تلطيخ LIVE / DEAD. كشفت الأغشية الحيوية الملطخة ب Ethidium homodimer-1 عن جزء صغير من مجموعة S.aureus الميتة داخل الغشاء الحيوي. كشف تأثير غسل الغشاء الحيوي والعدلات بعد 30 دقيقة من الحضانة لإزالة العدلات غير الملتصقة أن حوالي 33٪ من العدلات الميتة لا تزال مرتبطة بالغشاء الحيوي.
يمكن أيضا استخدام البروتوكولات المدرجة هنا لمزيد من الدراسة للوظائف الأخرى للعدلات ، مثل البلعمة ، وتشكيل مصائد العدلات خارج الخلية عندما تواجه العدلات الأغشية الحيوية.
