Bu protokoller, insan nötrofillerinin bakteriyel biyofilmlerle nasıl etkileşime girdiğini ve onları nasıl öldürdüğünü anlamak için tasarlanmıştır. Amaç, bunu daha iyi anlamak ve tahlilden tahlil arasındaki değişkenliği sınırlamak, donörden donör varyasyonuna kadar insan nötrofilleriyle ilgili doğal sorunlar olduğunu anlamaktır. Burada listelenen teknikler, kullanıcıların özellikle gevşek bir şekilde bağlanmış biyofilmlerle minimum değişkenlikle deneyler yapmalarını sağlamak için optimize edilmiştir.
Ek olarak, bu protokoller biyofilm oluşturabilecek diğer mikropları incelemek için de uyarlanabilir. Triptik soya agar gibi besin açısından zengin bir agar plakası üzerinde bir çizgi plakası tekniği kullanarak kriyokorunmuş bir stoktan izole Staphylococcus aureus kolonileri elde ederek başlayın. 96 delikli bir plakanın ayrı ayrı kuyularını steril suda seyreltilmiş 100 mikrolitre PLL ile kaplayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Vakum destekli aspirasyon tuzağı kullanarak PLL çözeltisini aseptik olarak aspire edin. Kuyuların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. MEM-alfa'da% 2 glikoz ile desteklenmiş ve dakikada 200 rotasyonda 16 ila 18 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilmiş bir S.aureus kolonisini aşılayarak bir gecelik kültür hazırlayın.
Gece kültürünü,% 2 glikoz ile desteklenmiş beş mililitre taze MEM-alfa'ya 50 mikrolitre aktararak seyreltin. Daha sonra logaritmik orta faz elde edilene kadar dakikada 200 dönüşte 37 santigrat derecede inkübe edin. Orta logaritmik kültürü 0,1 OD'ye normalleştirmek için MEM-alfa kullanın.
PLL'ye tabi tutulmuş 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 150 mikrolitre normalleştirilmiş kültür aktarın. Plakayı nemlendirilmiş bir odada 18 ila 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Planktonik hücreleri çıkarmak için süpernatantı aspire edin.
Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kalan biyokütleyi 150 mikrolitre HBSS ile nazikçe yıkayın. Tüm planktonik hücreleri çıkarmak için en az iki kez tekrarlayın. HBSS'de seyreltilmiş 100 mikrolitre% 20 normal insan serumunu yıkanmış biyofilme damla damla ekleyin ve biyofilmi opsonize etmek için 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Serum solüsyonunu aspire edin ve biyofilmleri damla damla 150 mikrolitre HBSS ile yıkayın. HBSS'yi aspire edin, opsonize biyofilmlerle kuyuları geride bırakın. Beş mikromolar luminolün son konsantrasyonunu oluşturmak için HBSS'de yeniden askıya alınan nötrofillere luminol ekleyin.
Bu çözelti A ve C grupları için kullanıma hazırdır.Luminol ile karıştırılmış nötrofilleri, opsonize biyofilmlerle kuyucuklara ekleyin. D grubu için, HBSS'de 50 mikromolar luminol çözeltisini nötrofil içermeyen ayrı bir tüpte hazırlayın ve biyofilmi içeren kuyuya ekleyin. Aliquot luminol ile karıştırılmış 350 mikrolitre nötrofiller ve karışıma mililitre başına 500 nanogramlık bir son konsantrasyonda PMA ekleyin.
B grubu için, bu karışımdaki nötrofilleri biyofilm içermeyen kuyucuklara ekleyin. Bu olumlu bir kontrol görevi görür. Plakayı 270 RCF'de dört santigrat derecede 30 saniye boyunca santrifüj yapın.
Plaka okuyucunun 37 santigrat dereceye ayarlandığından, lüminesans ve kinetik olarak üç dakikalık aralıklarla 60 dakika boyunca okunduğundan emin olun. 60 dakika boyunca nötrofiller tarafından ROS üretimini ölçmek için plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Mikroskopi görüntülemeyi kolaylaştırmak için GFP'yi ifade eden USA300 gibi bir floresan S.aureus suşu kullanın.
100 mikromolar BCD ile nötrofilleri% 5 atmosferik karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir rocker'da 30 dakika boyunca inkübe edin. Numunelerin karanlıkta inkübe edildiğinden emin olun ve ışığa maruz kalmayı sınırlayın. Fazla BCD'yi yıkamak için, nötrofilleri beş dakika boyunca 270 RCF'de santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin.
Nötrofilleri taze HBSS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, nötrofil ve bakteriyel ölümü izlemek için BCD boyalı nötrofillere dört mikromolar'lık son konsantrasyonda ethidium homodimer-1 ekleyin. Biyofilmi HBSS ile yıkayın ve mikroslaytlarda yetiştirilen S.aureus biyofilmine 150 mikrolitre nötrofil ekleyin.
Mikroslaytları nemlendirilmiş bir odada 30 dakika boyunca inkübe edin. Bakteriyel hücrelerin sayısı, 18 saatlik biyofilm kaplamasından elde edilen hücre sayımlarına dayanacaktır. Nötrofil biyofilm etkileşimini, floresan boyalara karşılık gelen floresan kanalları veya proteinlerin uyarımı ve emisyon dalga boylarını kullanarak görüntüleyin.
Bakteriyel büyüme ortamı, 30 dakikalık inkübasyon süresinden sonra nötrofillerin canlılığını yaklaşık% 60'a indirdi. Bununla birlikte, memeli hücre kültürü ortamı, nötrofillerin yaşayabilirliğini etkilememiştir ve ayrıca S.aureus biyofilmlerinin büyümesini de destekleyebilir. Kontrol olarak kullanılan PMA ile muamele edilen nötrofiller, ROS üretiminde artış gösterdi.
Biyofilmlerin yokluğunda, PMA ile muamele edilen nötrofiller sağlam ROS üretimi gösterdi. S.aureus biyofilminin varlığında, PMA ile muamele edilen nötrofillerin genel ROS üretimi azalırken, PMA'nın yokluğunda, nötrofiller yalnızca biyofilm ile etkileşimlerine dayanıyordu ve ROS üretimini daha da azaltıyordu. Geniş alan floresan mikroskopisi, birçok nötrofilin yüzeye lokalize olduğunu, birkaçının ise S.aureus biyofilmlerinde olduğunu ortaya koydu.
Nötrofiller ile etkileşime giren S.aureus hücrelerinin çoğu ölmüşken, birkaçı LIVE / DEAD boyama ile belirlendiği gibi hayatta kalmıştır. Ethidium homodimer-1 lekeli biyofilmler, biyofilm içindeki ölü S.aureus popülasyonunun bir kısmını ortaya çıkardı. Yapışmamış nötrofillerin çıkarılması için 30 dakikalık inkübasyondan sonra biyofilm ve nötrofillerin yıkanmasının etkisi, ölü nötrofillerin yaklaşık% 33'ünün hala biyofilme bağlı olduğunu ortaya koymuştur.
Burada listelenen protokoller, fagositoz gibi nötrofillerin diğer işlevlerini ve nötrofiller biyofilmlerle karşılaştığında nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunu daha fazla incelemek için de kullanılabilir.
