La piel contiene múltiples tipos de células, incluyendo queratinocitos, fibroblastos y células nerviosas de Schwann. Este protocolo permite el aislamiento de cada uno de estos tipos de células para experimentos in vitro. El aislamiento y el establecimiento de cultivos celulares primarios individuales de un solo donante permite comparaciones sólidas y experimentos de cocultivo, al tiempo que mitiga los efectos de la variación genética.
Con este protocolo, el análisis de células individuales y sus interacciones permite el análisis del papel de las células de Schwann en la homeostasis de la piel y la fisiopatología. Estas distintas poblaciones celulares se pueden utilizar para estudiar células de Schwann, fibroblastos o queratinocitos, ya sea individualmente o en combinación en la fisiología normal de la piel, la cicatrización de heridas o en estados enfermos de la piel. Jagadeeshaprasad M G, un becario postdoctoral en mi laboratorio, me ayudará a demostrar el procedimiento.
Después de adquirir el prepucio neonatal siguiendo los procedimientos estándar de atención, coloque el prepucio extirpado en un tubo de micro centrífuga que contenga de ocho a 10 mililitros de medio basal DMEM helado y transporte inmediatamente el prepucio al laboratorio de cultivo celular para el aislamiento celular. Enjuague el prepucio dos veces con 20 a 25 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS, que contenga antibióticos y antimicóticos. Luego remoje la piel lavada en 25 a 30 mililitros de medio basal DMEM helado en un plato de cultivo de tejidos de 10 centímetros.
Después de 15 minutos, corte el prepucio abierto con un bisturí para exponer la dermis y el tejido adiposo subcutáneo. Use fórceps, una cuchilla de bisturí y tijeras para extraer y desechar el tejido adiposo subcutáneo. Luego corte el prepucio limpio en tres a cinco piezas más pequeñas e incube las piezas de piel en 16 a 20 mililitros de Dispace un medio DMEM en un tubo cónico estéril.
Durante los primeros 30 minutos de incubación con Dispace se mezclan intermitentemente las piezas de piel en el tubo cónico por inversión. Luego coloque el tubo cónico a cuatro grados centígrados durante 16 a 18 horas. Al día siguiente retire los trozos de piel y colóquelos en un plato de cultivo estéril seco y desenrolle cada trozo de piel para que la capa externa de la epidermis esté tocando el plato de cultivo.
Comenzando en el borde del tejido, pelar la epidermis lejos de la dermis usando dos juegos de fórceps. Agregue los fragmentos separados de la epidermis a cinco mililitros de HBS en un plato de cultivo de 10 centímetros para incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego recoja la solución de HBS en un tubo cónico de 50 mililitros y agregue cinco mililitros de tampón de neutralización de tripsina o T y B en el tubo cónico.
Deje el tubo a un lado. A los fragmentos epidérmicos en el plato de cultivo agregue tres mililitros de solución de tripsina para incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, agite suavemente los fragmentos epidérmicos con fórceps hasta que la solución de queratinocitos de tripsina se vuelva turbia.
A continuación, agregue la solución de queratinocitos de tripsina al tubo HBS T y B. Después de disolver fragmentos epidérmicos no digeridos con solución de tripsina EDTA, agregue dos mililitros de FBS al tubo HBS T y B que contiene la solución de TRIPSina EDTA, y centrífuga los dos aproximadamente 870 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Luego aspire el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en tres mililitros de medio de crecimiento completo de queratinocitos, seguido de la filtración de la suspensión celular con un filtro estéril de 100 micrómetros en un tubo cónico estéril de 50 mililitros.
Una vez cuantificado el número de células y la viabilidad celular, sembra las células en las placas de cultivo para colocarlas en una incubadora a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. Después de dos días, aspire las células no adheridas y actualice los medios de cultivo celular cada dos días hasta que los queratinocitos alcancen entre el 50 y el 80% de confluencia para experimentos de paso o aguas abajo. Precoat T25 matraces con poli-l-lisina o PLL, utilizando cinco mililitros de DPBS y colocar los matraces preestucados a 37 grados centígrados durante tres horas.
Posteriormente lave la matriz de recubrimiento PLL dos veces con DPBS. Después de lavar las piezas aisladas de la dermis con cinco mililitros de medio basal DMEM, picar la dermis en trozos pequeños con tijeras. Digiera la dermis picada con cinco mililitros de colagenasa a 37 grados centígrados durante dos horas y media, con una titulación suave con una punta de pipeta cada 30 minutos hasta que la dermis se disocie por completo.
Una vez digerida, filtre la suspensión celular con un colador celular de 70 micrómetros, seguido de la dilución de la suspensión celular filtrada con cinco mililitros de medio DMEM completo para detener la actividad enzimática de la colagenasa. A continuación, centrifugue la suspensión celular a 870 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y resusponga la boleta celular en dos mililitros de medio completo DMEM para dividir las células. Después de repetir el proceso de centrificación como se describe, aspire el sobrenadante para usar el pellet celular para aislar las células de Schwann o fibroblastos.
Para aislar las células de Schwan, resuspenda la gránula celular en cinco mililitros de medio completo DMEM fresco y cuantificar el número de células y la viabilidad antes de sembrar cinco mililitros de las células resuspendidas en matraces T25 precodificados a una densidad de 4.0 veces 10 a las tres células por mililitro. Incubar el matraz a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 16 horas, confirme la adhesión celular mediante microscopía a un aumento de 10X.
A continuación, retire las células de no adherencia y lave el matraz tres veces con cinco mililitros de DPBS. A continuación, incubar las células con cinco mililitros de 10 arabinósidos de citosina micromolares en un medio completo DMEM. Después de 24 horas aspire el medio que contiene citosina arabinósido antes de enjuagar el matraz como se demostró anteriormente.
Rellene el matraz de cultivo con cinco mililitros de células de Schwann para incubar 48 horas, mientras refresca el medio cada dos días hasta que las células de Schwann alcancen el 80% de confluencia. Para aislar los fibroblastos, resuspendir el pellet recolectado en cinco mililitros de fibroblastos en medio completo. Cultivar las células en matraces de cultivo T25 no codificados durante 24 horas, como se ha demostrado para las células de Schwann.
Después de aspirar las células de no adherencia y lavar el matraz, incubar las células con cinco mililitros de fibroblastos frescos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. A medida que las células primarias aisladas se cultivaron en los respectivos medios de cultivo celular, los queratinocitos primarios alcanzaron el 85% de confluencia en el séptimo día y exhibieron una morfología celular característica con una forma de adoquín. Las células de Schwann alcanzaron el 95% de confluencia en el quinto día y parecían bipolares o de forma tripolar.
Los cultivos de fibroblastos alcanzaron el 95% de confluencia en el cuarto día y la mayoría de las células exhibieron una morfología en forma de huso. La tinción por inmunofluorescencia confirmó la expresión de proteínas específicas del tipo celular en los cultivos celulares. Los queratinocitos fueron positivos para la proteína K10 y K14.
Las imágenes combinadas de inmunofluorescencia de queratina y tinción nuclear DAPI indicaron una pureza del 97,8% de los cultivos celulares. Del mismo modo, las células de Schwann fueron positivas para S100 y P75 NTR y tuvieron una pureza del 95,2% en el cultivo. Los fibroblastos expresaron positivamente vimentina, pero no expresaron actina del músculo liso alfa, un marcador de miofibroblastos.
La pureza del cultivo fue de alrededor del 97,2% Para mejorar la evidencia de Shanse, se puede usar un plato de poli-l-lisina pre-recubierto. Y para mitigar aún más la contaminación fibrosa, se agregaron arabinósidos de citosina y agente antimicótico después de que las células se agregaron por un corto tiempo. Este es un procedimiento experimental simple y económico para establecer las tres células primarias, como las células shwann, los queratinocitos y los fibroblastos, a partir de una sola piel delantera humana.
Este protocolo es ideal para experimentos in vitro que involucran la comunicación celular o la diafonía entre tipos de células.
