Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

El aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios derivados del tejido queloide son la base para futuros estudios de queloides. Los fibroblastos del tejido queloide se pueden adquirir fácilmente a través de este protocolo, que puede proporcionar una fuente abundante y estable de células en el laboratorio para la investigación de queloides. Comience usando pinzas estériles para colocar el tejido queloide en un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros que contenga de 10 a 25 mililitros de PBS suplementado con PSA al 1%.

Mientras tanto, agregue cuatro mililitros de solución de PBS PSA a cada pocillo de una placa de seis pocillos. Ahora saque el pañuelo del tubo y lávese dos veces con la solución PBS PSA. Con un par de pinzas estériles, transfiera el tejido secuencialmente de un pocillo a otro.

A continuación, retire las capas adiposa y de la epidermis con unas tijeras quirúrgicas, dejando la dermis intacta. Use un par de tijeras para diseccionar la dermis recortada en trozos de tres a cinco milímetros cuadrados y transfiera los trozos al siguiente pocillo con un par de pinzas estériles. Lave las piezas en una solución de PSA de PBS.

Con pinzas esterilizadas, coloque de 10 a 30 piezas de tejido dérmico espaciadas a menos de cinco milímetros de distancia en placas de Petri. Coloque los platos boca abajo en una incubadora hasta que los trozos se sequen y se peguen al plato. A continuación, agregue siete mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSA, e incube las placas como antes.

Después de tres días, reemplace la mitad del sobrenadante con medio de cultivo completo. Observe los fibroblastos diariamente con un aumento microscópico de 40X. Retirar los trozos de tejido en el medio de cultivo cuando los fibroblastos alcancen el 90% de confluencia.

Lavar los fibroblastos en PBS y añadir dos mililitros de solución estéril de tripsina EDTA. Después de incubar las células en una incubadora humidificada, golpee suavemente la placa de cultivo y obsérvela bajo el microscopio. Agregue dos mililitros de medio completo para terminar la digestión una vez que la mayoría de las células se hayan desprendido.

Ahora transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y centrifugue el tubo a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender el gránulo celular en medio completo. Siembre los fibroblastos en una placa de cultivo celular de nueve centímetros e incube en una incubadora humidificada.

Para realizar el análisis inmunofluorescente después de cultivar los fibroblastos en cubreobjetos redondos e incubarlos en anticuerpos primarios y secundarios, agregue 50 microlitros de solución de DAPI al portaobjetos de vidrio para teñir los núcleos celulares. Coloque los cubreobjetos lavados en portaobjetos de vidrio con pinzas. Finalmente, transfiera las muestras a una caja oscura húmeda para microscopía fluorescente.

Se observaron excrecencias de fibroblastos en el tejido a los cinco días después del procesamiento. Los fibroblastos mostraron altas tasas de proliferación y alcanzaron la confluencia después de 10 días. Los fibroblastos tenían cuerpos celulares alargados y fusiformes, que estaban alineados en haces a alta confluencia.

La tinción inmunofluorescente arrojó resultados positivos para la inmunofluorescencia roja de los fibroblastos y la inmunofluorescencia azul del núcleo celular. Los ensayos de citometría de flujo mostraron positividad para CD90 en casi todos los fibroblastos. Este estudio ha descrito un método optimizado y ha proporcionado instrucciones claras para resolver los desafíos existentes y aumentar las posibilidades de éxito para el aislamiento y cultivo de fibroblastos queloides.