Este protocolo ayudará a los usuarios y enseñará a los estudiantes los pasos correctos en la extracción de BMA, AEG y 2, 4-DAB. Minimizando así las posibilidades de error y produciendo resultados consistentes. Este método es un método comúnmente utilizado y validado para la extracción de BMA y sus isómeros, AEG y 2, 4-DAB en una matriz bacteriana de sauna.
Este método se puede utilizar para ampliar la investigación sobre la toxicidad de BMA y proporcionar una mayor comprensión sobre BMA y sus efectos sobre la salud asociados. Comience por centrifusión la muestra de cianobacterias a 3, 500 G durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Y desechar el sobrenadante en desechos biológicos.
Cubra el tubo de centrífuga que contiene el gránulo con una película de sellado y perfore algunos agujeros en la película con una pinza nasal larga y afilada. Luego guarde el tubo en posición vertical a menos 80 grados centígrados. Después de 30 minutos, coloque el tubo en posición vertical en un recipiente de vidrio para liofilizadores y coloque el recipiente dentro del congelador de menos 80 grados centígrados durante cinco minutos para enfriarlo.
Retire el recipiente de vidrio del congelador y coloque la tapa de goma. Asegúrese de que el mango de la salida de la válvula de goma del liofilizador apunte hacia arriba y se ventile a la atmósfera. Fije firmemente el recipiente de vidrio.
Gire lentamente el mango de la salida de la válvula de goma para apuntarlo a una posición hacia abajo para exponer el frasco al vacío. Y permita hasta 24 horas de liofilización para sublimar todo el líquido. Cuando haya terminado, pese de 15 a 50 miligramos de gránulos de muestra congelados en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Utilizando una balanza analítica. A la muestra, agregue de 300 a 600 microlitros de ácido tricloroacético acuoso al 10% o TCA. Coloque los tubos de muestra en un recipiente lleno de hielo picado.
Limpie la sonda del sonicador con una toallita de papel sin pelusa rociada con etanol al 70% antes de sumergir completamente el extremo de la sonda en la muestra y presionar start. Una vez hecho esto, coloque la muestra que contiene el tubo de centrífuga en hielo durante un minuto. Y repita el proceso de sonicación para garantizar la lisis celular.
Después de enfriar la muestra a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Centrifugar a 3, 500 G durante 15 minutos a ocho grados centígrados. Luego, usando una micropipeta, transfiera el sobrenadante a un tubo de dos mililitros etiquetado como fracción libre.
Agregue 400 microlitros de TCA 10% acuoso en el pellet de muestra y rompa el pellet por agitación de vórtice o con la punta de micropipeta. Centrifugar y transferir el sobrenadante en el mismo tubo de fracción libre de dos mililitros. Repita este paso una tercera vez usando acetona 10% TCA.
Coloque el tubo de fracción libre con la tapa abierta en un evaporador centrífugo hasta que se elimine todo el líquido volátil. Una vez que la muestra esté libre de líquidos volátiles, cubra el tubo de forma segura con la película del techo y perfore la película con algunos orificios con una pinza nasal larga y afilada. Después de la liofilización demostrada anteriormente, reconstituya la muestra con 200 microlitros de ácido clorhídrico 20 milimolar y colóquela en un congelador de menos 80 grados centígrados.
Añadir 400 microlitros de acetona al 100% sobre el pellet de muestra con una micropipeta y romper el pellet utilizando la agitación del vórtice o la punta de la micropipeta. Transfiera cuantitativamente el pellet lavado y resuspendido al vial de cubierta de vidrio correspondiente. Usando una micropipeta de un mililitro.
Agregue otros 400 microlitros de acetona al tubo de muestra para ayudar a transferir el pellet restante. Centrifugar y decantar el líquido sobrenadante en residuos biológicos antes de secar el pellet en un evaporador centrífugo hasta que se elimine el líquido y el pellet esté seco. Para preparar el archivo de hidrólisis al vacío, agregue un mililitro de ácido clorhídrico de seis molares al fondo del archivo de hidrólisis.
Inserte cuidadosamente los viales de cubierta etiquetados con muestras secas en el archivo de hidrólisis utilizando pinzas que garanticen una posición vertical estable. Fije la tapa a la lima de hidrólisis y empuje la perilla roja de la tapa para cerrar la válvula. Después de encender la bomba de vacío, conecte el tubo de vacío al cabezal de la tapa del archivo de hidrólisis y presione la perilla verde en la tapa para abrir la válvula.
A continuación, permita que la bomba de vacío elimine el aire del vial durante un minuto. A continuación, cierre el vial presionando la perilla roja de la tapa del vial de hidrólisis. Apague la bomba de vacío y retire el tubo de vacío.
Conecte un tubo de goma al grifo de gas nitrógeno en el banco de laboratorio. Y abre un poco el grifo. Coloque el pulgar en el extremo del tubo, séllelo y cuente hasta que el gas comience a escapar a medida que aumenta la presión.
A continuación, fije el otro extremo del tubo de goma a la cabeza de la tapa del vial de hidrólisis. E inmediatamente empuje la perilla verde de la tapa. Cuente el tiempo que tardó el gas en escapar.
Empuje rápidamente la perilla roja de la tapa y retire el tubo de goma. Repita todo el proceso de tratamiento al vacío dos veces. Asegurarse de que el vial de hidrólisis de vidrio esté libre de aire y lleno de gas nitrógeno.
Coloque el vial de hidrólisis en un horno precalentado a 110 grados centígrados durante 16 a 18 horas. Con guantes de horno, retire el vial de hidrólisis de vidrio del horno. Deje que el vial se enfríe dentro de la campana extractora durante 10 minutos antes de empujar la perilla verde mientras la mira hacia afuera para liberar presión y gas.
Reconstituya los pellets de muestra hidrolizados con 200 microlitros de ácido clorhídrico 20 molar en el vial de la cubierta y vuelva a suspender el pellet. Centrifugar los viales de la cubierta que contienen los gránulos de muestra reconstituidos durante dos minutos a 5, 300 G y 25 grados centígrados. Transfiera las muestras de fracción libre reconstituidas y la fracción de proteína a los tubos filtrantes de dos mililitros que contienen filtros de membrana de poro de 0,2 micras y etiquetados como fracción libre y fracción de proteína.
Coloque los tubos para centrifugación durante 30 minutos a 5, 000 G y 25 grados centígrados. Aquí se muestra el cromatograma de monitoreo de reacciones múltiples de un estándar que contiene beta-metilamino-L-alanina o BMAA y sus isómeros indicados por las líneas codificadas por colores. Se observó una detección positiva para los tres isómeros, BMAA, DAB y AEG en la fracción libre de las especies de Merismopedia recolectadas en el lago Liddel.
Mientras que la fracción unida de la especie Microcystis flos-aquae recolectada de Waka Waterworks ilustró un resultado negativo para BMAA y sus isómeros. El pellet resuspendido debe transferirse cuantitativamente al vial de la cubierta correspondiente para permitir un punto preciso de normalización basado en la masa de cianobacterias. Se aconseja a los pacientes y la debida diligencia mientras realizan este paso.
Siguiendo este procedimiento. Las fracciones extraídas tendrán que someterse a un paso de desvitalización para permitir la fase inversa. Cromatografía líquida, análisis de espectrometría de masas en tándem.
La aplicación de esta técnica amplía diversos campos científicos. Incluyendo las ciencias ambientales a través del análisis de cinotoxinas en muestras ambientales. Y campos como la toxicología y la bioquímica a través de la investigación de la teoría de la mala incorporación de BMA.
