Este protocolo le ofrece una descripción general paso a paso sobre cómo preparar perlas para la limpieza de afinidad y la proteólisis de proteínas y cómo usarlas en la determinación de proteínas de baja abundancia a partir de micromuestras secas. La principal ventaja es que se le dan las herramientas para preparar y realizar muestreos altamente eficientes de muestras complejas a partir de volúmenes muy pequeños. Este método se puede adaptar a otros biomarcadores de proteínas, siempre y cuando tenga acceso a anticuerpos eficientes para capturar la proteína o el péptido proteotípico.
Debe tener mucho cuidado al ajustar el pH para el tratamiento ácido del anticuerpo, especialmente si prepara un pequeño volumen de perlas. Para comenzar, transfiera el volumen deseado de solución de anticuerpos a un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de cinco mililitros y agregue una pequeña barra de agitación magnética a la solución de anticuerpos. Use un medidor de pH con un microelectrodo para medir el pH y ajuste el pH agregando primero 10 microlitros de ácido clorhídrico molar y luego reduciendo el volumen a medida que el pH se acerca a 2.5.
Registre el volumen total de ácido clorhídrico de un molar necesario para ajustar el pH a 2.5. Retire el microelectrodo e incube el anticuerpo acidificado en hielo, en un agitador magnético durante una hora. Para neutralizar la solución de anticuerpos, mida el pH y ajústelo a siete agregando primero 10 microlitros de hidróxido de sodio de un molar y luego reduciendo el volumen de hidróxido de sodio a medida que el pH se acerca a siete.
Registre el volumen total de hidróxido de sodio de un molar agregado. Mezcle bien la suspensión de perlas magnéticas en un mezclador de vórtice y retire un volumen que contenga la cantidad deseada de suspensión de perlas. Por ejemplo, para preparar un mililitro de suspensión de cuentas, retire un volumen que contenga 20 miligramos de perlas.
Coloque la suspensión del talón en una rejilla magnética durante un minuto y retire el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con un volumen igual de agua tipo I y mezcle con un mezclador de vórtice después de cada adición de la solución de lavado. Luego, coloque la solución nuevamente en una rejilla magnética durante un minuto y retire el sobrenadante como se mostró anteriormente.
Agregue anticuerpo tratado con ácido, tampón de borato 0.5 molar y tampón de acoplamiento para el acoplamiento de anticuerpos a las perlas magnéticas. Mezclar con un mezclador de vórtice y rotar a temperatura ambiente durante la noche utilizando un mezclador de muestras de extremo a extremo, preferiblemente con rotación y vibración recíprocas. A continuación, centrifugar durante 10 minutos a 239 g.
Coloque el tubo en el imán durante dos minutos y retire el sobrenadante. Después de lavar las perlas, coloque el tubo nuevamente en el imán durante un minuto y siga el mismo procedimiento para eliminar el sobrenadante. Almacene esto en el búfer deseado utilizando la concentración de perlas deseada en un refrigerador.
Permita que se recojan 10 microlitros de suero en una punta de micromuestreo de absorción volumétrica de 10 microlitros, o VAMS, siguiendo las pautas del fabricante, y seque al aire a temperatura ambiente durante al menos dos horas. Retire el VAMS del soporte y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de dos mililitros. Agregue 1, 000 microlitros de solución de bicarbonato de amonio 100 milimolar y extraiga VAMS durante una hora a 22 grados centígrados usando un mezclador de temperatura controlada a 1, 000 rpm.
Transfiera el extracto a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 mililitros para la proteólisis tríptica. Agregue 30 microlitros de perlas de tripsina lavadas a cada extracto de VAMS para iniciar la digestión e incube durante dos horas a 37 grados centígrados y 1, 000 rpm con un mezclador de temperatura controlada o similar. Centrifugar a 2, 655 g durante cinco minutos, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de dos mililitros.
Agregue 25 microlitros de solución estándar interna de 14 nanogramos por mililitro, o IS, que contenga el péptido marcado con isótopos estables en una solución de bicarbonato de amonio de 100 milimolares. Agregue dos 20 microlitros de suspensión de perlas magnéticas lavadas a cada tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas que contenga un extracto VAMS digerido e IS. Realizar la inmunoextracción durante una hora utilizando un mezclador de muestras de extremo a extremo a temperatura ambiente. Lave las perlas magnéticas agregando 500 microlitros de PBS con 20,05% de polisorbato.
Retire el tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas que contiene perlas y solución de lavado de la rejilla magnética, e invierta con cuidado hasta que quede homogéneo. Luego, coloque el tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas en el imán durante 30 segundos, invierta durante 30 segundos y colóquelo nuevamente en el imán durante un minuto. Retire la solución de lavado y vuelva a lavar las perlas magnéticas con PBS, ácido clorhídrico tris y bicarbonato de amonio.
Agregue 15 microlitros de ácido fórmico al 2% en agua tipo I a cada muestra e incube durante cinco minutos a 22 grados centígrados y 1, 000 rpm usando un mezclador de temperatura controlada o similar para eluyir los péptidos capturados. Después de colocar el eluido en el imán durante un minuto, transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 mililitros. Repita una vez y transfiera el segundo eluido al mismo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas que el primer eluido.
Agregue 20 microlitros de bicarbonato de amonio 100 milimolar a cada eluido. Centrifugarlo y transferir 40 microlitros del eluido a microinsertos para viales de HPLC. En el software del instrumento, ajuste la temperatura del horno de columna a 25 grados centígrados y el caudal a 50 microlitros por minuto.
A continuación, coloque las muestras en el muestreador automático. Prepare una secuencia que contenga las muestras que se ejecutarán utilizando el software disponible para el sistema LC-MS/MS y ajuste el volumen de inyección a 10 microlitros. Presione Run Sequence en el software del instrumento para iniciar la secuencia y registre el área pico del péptido tríptico capturado por afinidad, específico de ProGRP y su IS. Aquí se muestran los cromatogramas de espectrometría de masas, o MS, del péptido proteotípico y el IS después de VAMS y el muestreo de suero seco, o DSS, así como para una muestra de suero con púas agregada directamente a la solución de extracción.
En esta figura se muestran los resultados representativos de la relación entre el área máxima del péptido proteotípico ProGRP a IS para muestras de suero enriquecidas con ProGRP y aplicadas a VAMS, DSS o directamente a la solución de extracción. A partir de estos resultados, se puede ver que VAMS proporciona relaciones de área similares a las de la muestra de control, lo que indica que no hay pérdida en el material de muestreo, mientras que DSS proporciona una relación de área significativamente menor, lo que indica pérdida para el material de muestreo. En esta figura se presenta una comparación de los cromatogramas de pico base después de la extracción de proteínas intactas y la extracción del péptido de epítopo proteotípico.
Cuando usted mismo prepara perlas recubiertas de anticuerpos o enzimas, puede adaptar las perlas para cubrir sus necesidades específicas. Esto es relevante para la determinación de proteínas dirigidas y el análisis proteómico global. Los métodos sensibles en la determinación de proteínas de VAMS y manchas de sangre seca hacen que los enfoques orientados al paciente, como las pruebas fuera del hospital, sean posibles en el seguimiento de una gama más amplia de enfermedades.
