Esta es la primera vez que se desarrolla un método para la medición resuelta en el tiempo de los niveles del transmisor peptídico in vivo. Podemos medir los niveles del transmisor de péptidos en sujetos individuales y ubicaciones discretas con análisis casi en tiempo real. Primero, corte una longitud de 25 centímetros de alambre de platino recubierto de perfluoroalcoxi.
Luego, usando un bisturí, retire aproximadamente cinco milímetros de recubrimiento de perfluoroalcoxi de un extremo, con cuidado de no cortar el alambre de platino. Ahora, inserte el extremo pelado del cable de platino en un pin conector macho de un milímetro chapado en oro. Luego, usando alicates de nariz de aguja, engarce los dientes del pasador del conector alrededor del extremo pelado del cable de platino y suelde el cable de platino al pin del conector chapado en oro.
A continuación, prepare la solución de dopamina agregando 50 miligramos de clorhidrato de dopamina en 50 mililitros de PBS 10 milimolares con pH seis y mezcle revolviendo. Después de disolver completamente la dopamina, coloque la punta del alambre de platino en el recipiente que contiene el PBS recién hecho suplementado con dopamina. Conecte el electrodo de disco de cloruro de plata al canal de tierra en la etapa principal.
Luego, coloque el disco de cloruro de plata en el recipiente que contiene PBS suplementado con dopamina y alambre de platino. Antes de continuar, conecte una derivación de cable a los canales de referencia de la etapa de la cabeza. Abra el software interactivo de adquisición de datos y establezca un protocolo de potencial de comando de electrodeposición de diente de sierra estableciendo el potencial de inicio en menos 0,6 voltios, el potencial de fin en 0,65 voltios, la velocidad de escaneo en 0,04 voltios por segundo y la duración de la deposición en 420 segundos.
Después de completar la deposición de poli-dopamina, retire el gránulo molido de cloruro de plata y la punta del alambre de platino del recipiente. Coloque la punta del cable en un microtubo que contenga PBS de pH 7.4 durante dos a cinco minutos y asegúrese de que la punta del cable no entre en contacto con los lados o la parte inferior del microtubo. Luego, prepare la solución de anticuerpos combinando el anticuerpo de interés con el PBS de pH 7.4 en una proporción de 1:20 en un vaso de tamaño apropiado.
A continuación, remoje la punta depositada de poli-dopamina del electrodo de platino en solución de anticuerpos durante dos horas a temperatura ambiente, asegurándose de que la punta del alambre de platino esté suspendida en solución y no descanse en la superficie interior del microtubo. Coloque la punta funcional de la inmunosonda capacitiva en la cámara de flujo, teniendo cuidado de no perturbar la punta del electrodo de ninguna manera, ya que hacerlo puede dañar la punta sensorial de la sonda. Antes de la primera prueba experimental, realice una ejecución estándar TBS para acondicionar la sonda de inmunosonda capacitiva y, para el protocolo de voltaje, establezca el potencial de paso positivo en 110 milivoltios, el potencial de paso negativo en menos cinco milivoltios, la duración del paso de 20 milisegundos y la duración de la adquisición en 600 segundos.
A continuación, cree la solución peptídica de interés utilizando el mismo TBS para mantener la composición del superfusado. Configure un sistema de variedades en el que el superfusato se pueda cambiar entre TBS y TBS suplementado con péptidos. Utilice los parámetros estándar de TBS y configure el protocolo de adquisición de datos de detección de péptidos estableciendo la duración de la adquisición en 360 segundos.
Antes de la deposición de poli-dopamina, enhebra la punta expuesta del electrodo de alambre de platino a través de una aguja hipodérmica de calibre 22, dejando aproximadamente dos milímetros más allá de la punta de la aguja. Use fórceps y doble suavemente la punta del electrodo de alambre de platino para crear una púa que cuelgue del extremo de la aguja hipodérmica. Retire suavemente la aguja de la punta de púas, dejando suficiente alambre para colocar en el vaso sin que la aguja entre en contacto con el fluido y proceda con la deposición de dopamina como se demostró anteriormente.
Ahora, enjuague la punta de la sonda de púas con PBS y colóquela en la solución de anticuerpos. Luego, retire suavemente la punta funcionalizada del PBS. Mueva la aguja hipodérmica a la inmunosonda capacitiva de púas e implante suavemente en la región de interés antes de conectar el pasador del conector dorado en la etapa de la cabeza.
Una vez implantada, retire la aguja hipodérmica, dejando el electrodo en su lugar. Un paso positivo en el potencial de comando mide la corriente de inyección requerida para sujetar el voltaje de la sonda y permite la medición de la corriente capacitiva. El paso de potencial de comando negativo elimina el péptido unido del anticuerpo a través de la repulsión electrostática.
La forma de onda del comando de la función de paso representaba la detección iterativa resuelta en el tiempo y la cuantificación del péptido. La traza inferior representaba el potencial de comando y la corriente resultante bajo la superfusión de la sonda en TBS. La inmunosonda capacitiva equilibrada mostró un deterioro inicial más pequeño y una línea de base estable durante seis minutos.
El flujo del neuropéptido Y en la cámara de flujo aumentó las corrientes capacitivas sobre la línea de base. Las corrientes de inmunosonda capacitiva medidas con una sonda funcionalizada con anticuerpos neuropéptido Y mostraron una señal dependiente de la concentración sensible al neuropéptido Y de bajo picomol Para la calibración, se midió una curva estándar para todas las concentraciones probadas. La estimulación del ganglio estrellado bilateral mostró un neuropéptido Y elevado cuando se co-graficó con las corrientes capacitivas de control negativo.
La liberación de norepinefrina medida bajo estimulación estrellada mostró una liberación sincrónica con el neuropéptido Y, consistente con una respuesta simpática evocada. El desarrollo de estas técnicas puede proporcionar lecturas intraoperatorias de moduladores clave de la actividad cardíaca, proporcionando así una posible orientación terapéutica o intervencionista rápida. La técnica como se presenta aquí es específica para el despliegue cardiovascular, sin embargo, la técnica en sí es apropiada para otros entornos fisiológicos, como orina, músculo esquelético, riñones, tejido adiposo, etc.
