Nada de esto hubiera sido posible sin el apoyo de Nasser Rusan. Me gustaría agradecer a H. Doug Morris, Danielle Donahue y Brenda Klaunberg del Centro de Imágenes de Ratones de los NIH y a Ben Ache de Micro Photonics por su capacitación y discusión útil. También agradezco a Mansoureh Norouzi Rad de Zeiss por escanear muestras de abdomen en el Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith y Rachel Ng también ayudaron con el escaneo. Mike Marsh de Object Research Systems proporcionó soporte técnico a Dragonfly. También estoy agradecido por el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (1K22HL137902-01) y los Fondos de Puesta en Marcha de la Universidad de Wyoming. También agradezco a los revisores anónimos por sus útiles sugerencias y comentarios.

1. Selección de muestras y preparación de la cutícula
<ol><li>Elija el punto de tiempo de desarrollo apropiado (embrión, larva, pupa o adulto) para las imágenes.<ol>
<li>Para las etapas embrionarias, las hembras de jaula en placas de agar de jugo de uva se untan con pasta de levadura y recolectan huevos cada 30-60 min. Deje que estos embriones se desarrollen a 25 °C hasta que se alcance la etapa adecuada.</li>
		<li>Para las etapas larvales, recolecte el primer y segundo instars de los experimentos de recolección de embriones cronometrados. Elija directamente los3º instars errantes del lado del vial de alimentos en condiciones de no hacinamiento.</li>
		<li>Para el tiempo de pupa, recoja las pre-pupas blancas (espiráculos invertidos) y tome nota del momento en que la cutícula comienza a dorarse. Los animales progresarán a través de 15 etapas del desarrollo de las pupas en puntos de tiempo definidos después del pardeamiento de la cutícula y se pueden recolectar en consecuencia42.</li>
		<li>Recolecte adultos como vírgenes después de la eclosión y deje envejecer en un vial de alimentos durante un período de tiempo requerido (por ejemplo, 5 días para el desarrollo intestinal completo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera 5-50 animales a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de Tritón X-100 al 0,5% en solución salina tamponada con fosfato 1x (0,5% PBST). Mientras golpea el tubo periódicamente en la mesa de trabajo, incube durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) para ayudar a eliminar el recubrimiento hidrófobo y permitir que los animales se sumerjan por completo.<ol>
<li>Para las etapas embrionarias, larvales y pupales, deténga un mayor desarrollo colocando el tubo en un bloque de calor ajustado a 100 ° C durante 20 s seguido de un enfriamiento a RT durante 5 min. NOTA: Los animales también pueden ser congelados en nitrógeno líquido37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fijación y tinción
<ol><li>Retire el 0.5% de PBST y agregue 1 ml de la solución de Bouin. Tubo de grifo para garantizar que los animales estén completamente sumergidos. PRECAUCIÓN: Bouin's Solution contiene formaldehído. Puede causar toxicidad aguda en la piel y los ojos si se derrama y puede ser fatal si se ingiere. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio cuando manipule. NOTA: También se pueden emplear técnicas de fijación adicionales, como el uso de etanol. Los méritos de otros fijadores se describen en detalle en ref.1,30.<ol>
<li>Para muestras de embriones y adultos, incube en la mesa de trabajo durante 16-20 h en RT.</li>
		<li>Para muestras de larvas y pupas, fije los animales durante 2 h en RT. Deseche la solución de Bouin y lávela con 1x PBS durante 5 minutos tres veces. Transfiera a un plato de disección de múltiples pozos que contenga 1x PBS y use un pequeño pasador minutien conectado a un soporte para hacer un agujero en la cutícula anterior y posterior, teniendo cuidado de no interrumpir ningún tejido blando subyacente.</li>
		<li>Transfiera las muestras de larvas y pupas a un tubo de microfuge y agregue 1 ml de solución fresca de Bouin. Incubar en sobremesa durante 24 h en RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la solución de Bouin y lave la muestra durante 30 min con 1 ml de tampón de lavado de μ-CT (0,1 M Na2HPO4,1,8% de sacarosa) o 1x PBS tres veces.</li>
	<li>Agregue 1 ml de la solución de tinción adecuada e incube en la mesa de trabajo durante 2-7 días. NOTA: La elección de la tinción dependerá de muchos factores, pero generalmente es un equilibrio entre la penetración, el tiempo de incubación y la resolución. En general, el ácido fosfotúngstico (PTA) proporciona un contraste y una resolución superiores de los tejidos blandos, pero requiere una interrupción mecánica de la cutícula y tiempos de incubación más largos. Los méritos de los diferentes tipos de manchas se describen en detalle en la ref.1.<ol>
<li>Para la tinción de yodo, use 1 ml de 0.1 N I2KI (Solución de Lugol). Incubar durante 2 días. No es necesaria ninguna otra interrupción de la cutícula adulta.</li>
		<li>Para la tinción de ácido fosfotrástico (PTA), use 1 ml de una solución al 0,5% (p/v) diluida en agua. Interrumpa la cutícula adulta, ya sea quitando las piezas bucales o haciendo agujeros en el tórax o la cutícula abdominal con un pequeño alfiler minutien unido a un soporte. Incubar durante 5-7 días, o más si la tinción tisular parece no homogénea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar con 1 ml de agua ultrapura o 1x PBS durante 30 min. Repita el paso de lavado. Almacene los animales en RT en agua ultrapura o 1x PBS por hasta un mes.</li>
	<li>Si los animales van a ser escaneados mientras están hidratados, vaya directamente a la sección 4. Si se necesita una conservación más larga de la muestra, continúe con la sección 3 del protocolo.</li>
</ol>3. Secado en punto crítico (opcional)
<ol><li>Realizar una serie de deshidratación de etanol (EtOH) en la muestra: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Añadir 1 ml de la solución de EtOH e incubar en la mesa de trabajo durante 1 h por cada concentración en el orden indicado.</li>
	<li>Después del remojo final de EtOH al 100%, reemplácelo con EtOH 100% fresco y deje que la muestra se incube en la mesa de trabajo durante la noche.</li>
	<li>Realice el secado en puntos críticos de las muestras siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: Las instalaciones de microscopía electrónica generalmente tienen una máquina de secado de punto crítico (ver Tabla de Materiales)que realizará el secado de la muestra después de la deshidratación de EtOH.</li>
</ol>4. Montaje de la muestra
<ol><li>Para muestras secas de punto crítico, muestras de pegamento caliente a un pasador de insecto u otro soporte diseñado para caber dentro del mandril de la etapa giratoria o colocarlo en un tubo capilar de plástico o vidrio (~ 1.0-1.25 mm de diámetro interior).</li>
	<li>Para muestras hidratadas, llene la punta de una pipeta P10 con agua y asegure el extremo estrecho mediante sellado térmico o película de parafina para evitar fugas. PRECAUCIÓN: Asegúrese de envolver bien las conexiones para que el agua no se filtre en el escáner y cause daños.<ol>
<li>Transfiera una sola muestra a la punta de la pipeta con pórceps. Usando un objeto largo y delgado, como una aguja opaca de 20 G u otra punta de pipeta, empuje cuidadosamente la muestra hacia abajo de la punta hasta que entre en contacto con la pared de la punta de la pipeta para mantenerla en su lugar.</li>
		<li>Cubra la abertura de la punta de la pipeta con una película de parafina para evitar la evaporación del agua durante los escaneos largos.</li>
		<li>Monte la pipeta P10 utilizando un soporte diseñado para caber dentro del mandril de la etapa giratoria (Figura 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Escaneo
<ol><li>Realice las calibraciones necesarias de la máquina antes de tomar imágenes durante el día. NOTA: Estos variarán según el fabricante y se recomienda consultar con un especialista en aplicaciones para determinar los pasos adecuados. Consulte la Tabla de materiales para obtener información específica sobre la configuración y el software utilizado en este protocolo. En general, las calibraciones, como la alineación del eje de la etapa para eliminar cualquier "bamboleo" asociado con el mandril que está fuera del eje en relación con la etapa giratoria y la realización de correcciones de campo plano para garantizar intensidades uniformes de píxeles de fondo en la cámara, proporcionan condiciones de imagen óptimas para la mejor resolución y conjuntos de datos que son comparables en múltiples escaneos.</li>
	<li>Abra la puerta del escáner para acceder al mandril de la etapa giratoria haciendo clic en el icono 'Abrir puerta' en la esquina superior izquierda del software. Fije la muestra apretando el collar alrededor de la base del portavasos. NOTA: Utilice una presión suave al conectar la muestra al mandril giratorio para mantener la alineación del escáner.</li>
	<li>Establezca parámetros de escaneo en el software que controla el escáner para obtener una resolución y un contraste óptimos. NOTA: Estos deberán determinarse empíricamente, ya que la fuente de rayos X, la cámara / detector y la geometría de cada escáner variarán según el fabricante. También se puede encontrar información adicional para seleccionar los mejores parámetros aquí43, así como del especialista en aplicaciones del fabricante.<ol>
<li>Abra el control de alimentación de la fuente de rayos X (Opciones | Fuente de rayos X). Utilice las barras deslizantes para establecer el voltaje de rayos X a 30-40 kV y la corriente a 100-110 μA para producir un haz de rayos X con 3-4W de potencia y un tamaño de punto pequeño para una resolución mejorada.</li>
		<li>Utilice el cuadro de diálogo Modos de adquisición (Opciones | Modos de adquisición)para establecer el tiempo de exposición de la cámara a 500-800 ms.</li>
		<li>Utilice la barra deslizante situada junto al icono de la lupa en la parte inferior del software para establecer el tamaño de píxel de imagen deseado (~ 700 nm a 4 μm), dependiendo de la configuración y la posición de la cámara. Esto determina el número de imágenes de proyección que se adquieren durante el escaneo, con más proyecciones que conducen a una resolución mejorada pero tiempos de escaneo más largos (consulte Resultados representativos).</li>
		<li>Haga clic y arrastre la barra deslizante ubicada junto a la flecha giratoria en la parte inferior del software para mover la muestra a lo largo de su trayectoria de rotación de 360°. Asegúrese de que la muestra permanezca dentro del campo de visión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga clic en el icono'Iniciar adquisición'(icono de flecha circular azul) en la parte superior del software. Aparece un cuadro de diálogo que permite establecer parámetros de escaneo adicionales y nombrar el archivo y la carpeta de salida donde se guardará el escaneo.<ol>
<li>Establezca el movimiento aleatorio en 10 y promedie 4-6 cuadros. El paso de rotación se calcula automáticamente en función de la configuración de la cámara utilizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comience el análisis haciendo clic en 'Aceptar' en el cuadro de diálogo Adquisición. Aparece un segundo cuadro de diálogo de la barra de progreso que muestra el tiempo de escaneo. El escáner ahora adquirirá una serie de imágenes de proyección(Figura 1D)de la muestra a lo largo de la ruta de rotación y no necesita ser monitoreado.</li>
</ol>6. Reconstrucción
<ol><li>Para generar los tomogramas, realice la reconstrucción de imágenes utilizando las imágenes de proyección. NOTA: Si bien casi todas las reconstrucciones de imágenes de escáneres de geometría de haz cónico se basan en el algoritmo Feldkamp16,los parámetros individuales variarán según la implementación del software y deben determinarse empíricamente. Las siguientes configuraciones, específicas para un software disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales)se pueden utilizar como guía. Parámetros como la compensación de desalineación, la reducción de artefactos de anillo y la corrección de endurecimiento del haz (0% para la mayoría de las muestras de moscas) se realizan de manera iterativa para elegir los mejores valores para la reconstrucción final. Para los usuarios avanzados que deseen un mayor control sobre el proceso de reconstrucción, consulte la interfaz de MATLAB aquí44.</li>
	<li>Realizar una alineación inicial de la imagen utilizando un algoritmo de corrección de desplazamiento basado en escaneos de referencia45 (Acciones | Alineación X/Y con un escaneo de referencia).
</li>
	<li>Ajuste cada parámetro de reconstrucción (Iniciar | Ajuste fino). Esto activa un cuadro de diálogo 'Ajuste fino de parámetros'.<ol>
<li>Ajuste la alineación haciendo clic en'Siguiente'a'Post-Alineación'. Establezca el número de iteraciones en cinco y el paso del parámetro en 1.0. Haga clic en el botón Inicio para generar una serie de vistas previas. Seleccione la imagen que está correctamente alineada. NOTA: Una imagen correctamente alineada no será borrosa ni mostrará artefactos de "cizallamiento" donde una estructura continua (como la cutícula) aparece dividida.</li>
		<li>Ajuste la reducción del artefacto del anillo haciendo clic junto a él. Establezca el número de iteraciones en cinco y el paso del parámetro en 1.0. Haga clic en el botón Inicio para generar una serie de vistas previas. Seleccione la imagen que contiene el menor número de anillos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que los parámetros anteriores se hayan optimizado para dar la mejor imagen, asegúrese de que los valores seleccionados estén representados correctamente en la pestaña Configuración (Configuración).
</li>
	<li>Ajuste cualquier valor final de brillo y contraste utilizando el histograma, los parámetros del archivo, como la profundidad de bits y el tipo, y utilice una Región de Interés (ROI) que abarque solo las estructuras de interés (por ejemplo, solo mosca completa o cabeza) para reducir el tiempo computacional(Salida).</li>
	<li>Comience la reconstrucción (Iniciar | Inicio). Si se requieren varias reconstrucciones, agregue la imagen actual al administrador de lotes (Iniciar | Agregar al lote) y repita los pasos 6.2-6.5 para las imágenes restantes.</li>
</ol>7. Análisis de imágenes
<ol><li>Visualice tomogramas en dos y tres dimensiones y realice análisis morfométricos adicionales con software gratuito o comercial. NOTA: Los detalles del software utilizado en este protocolo están disponibles en la Tabla de Materiales. Otros paquetes de software que son capaces de evaluar conjuntos de datos μ-CT incluyen opciones gratuitas como FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47e ITK-SNAP48,además de software comercial (por ejemplo, AMIRA). Otras aplicaciones que emplean algoritmos basados en aprendizaje automático para semiautomatizar el proceso de segmentación pueden ayudar a acelerar los flujos de trabajo y reducir el sesgo humano (por ejemplo, Biomedisa49).</li>
	<li>Importe el archivo de tomograma en el software (Archivo | Importar archivos de imagen). Los metadatos asociados con el archivo deben cargarse automáticamente en la ventana, pero también se pueden configurar manualmente para que coincidan con las propiedades de la imagen.</li>
	<li>Para segmentar una estructura de interés, haga clic en la pestaña Segmento en el lado izquierdo de la pantalla. Crear una nueva región de interés (ROI) (Basic | Nuevo),así que le dé un nombre y seleccione un color apropiado.</li>
	<li>Definir el rango de umbral que abarca la estructura de interés (Rango | Definir rango) utilizando la barra deslizante.</li>
	<li>Seleccione un modo de herramienta de pintor de ROI 2D o 3D apropiado(ROI Painter | Opción de pincel).
</li>
	<li>Pintar un área definida por el umbral; mantenga presionada la tecla Ctrl mientras mantiene presionada la tecla izquierda del mouse. Para eliminar un área, mantenga presionada la tecla Mayús mientras mantiene presionada la tecla izquierda del mouse. NOTA: Para cambiar el tamaño del pincel circular o cuadrado, simplemente desplácese por la rueda del mouse mientras mantiene presionadas las teclas Ctrl o Mayús.</li>
	<li>Continúe pintando la estructura de interés a lo largo de todo su volumen Z.</li>
	<li>Convierta el ROI en una malla(Export | A una | de malla Normal).
</li>
	<li>Resalte la superposición de malla haciendo clic en ella en el panel Propiedades y configuración de datos en la esquina superior derecha.</li>
	<li>Suavizar la malla utilizando un número adecuado de iteraciones (Smooth Mesh | Iteraciones). NOTA: Utilice el mismo valor de iteración de suavizado de malla para todas las imágenes que se van a comparar.</li>
	<li>Asegúrese de que las mediciones del ROI de la malla(Área de superficie, volumen y diámetro de Feret)se muestren en el panel Información en el lado derecho de la pantalla para el análisis morfométrico básico. Se pueden realizar análisis adicionales utilizando el módulo de análisis de objetos.</li>
	<li>Renderice el objeto de malla y toda la imagen del tomograma y visualícela en 3D. Utilice el Movie Maker integrado para generar un vídeo del objeto ( Clic con elbotón derecho del ratón | Mostrar Movie Maker) utilizando fotogramas individuales del visor (Agregar clave). NOTA: También se pueden aplicar varias mejoras visuales a la película utilizando la pestaña de efectos visuales en el panel de la derecha para resaltar ciertas características, etc.</li>
	<li>Exporta el vídeo para verlo con el botón Exportar animación de Movie Maker.</li>
</ol>

El autor no declara intereses contrapuestos o financieros.

Visualizar Drosophila melanogaster intacto en todas las etapas del desarrollo ha seguido siendo un desafío, principalmente debido a la incompatibilidad de la microscopía de luz con la cutícula gruesa y pigmentada que se encuentra en este animal. Mientras que otros métodos de imagen animal completo, como la Resonancia Magnética (RM), la Tomografía de Coherencia Óptica (OCT), y la ultramicroscopía junto con el desbroce de tejidos se han utilizado con éxito en moscas50,51, 52,53,54,μ-CT presenta una serie de ventajas que lo hacen ideal para la obtención de imágenes animales completas de este organismo13,15,30 . Los rayos X penetran fácilmente en la cutícula pigmentada y su pequeña longitud de onda permite obtener imágenes submúmétricas. El etiquetado requiere una inversión mínima en productos químicos ampliamente disponibles y no tiene habilidades especializadas en el banco13. los escáneres μ-CT también están disponibles comercialmente, y los costos son comparables a las plataformas de microscopía de luz, al tiempo que son más atractivos para una gama más amplia de disciplinas (Geología, Paleontología, Ingeniería, etc.) que también pueden beneficiarse de su disponibilidad en una institución. Las fuentes de rayos X sincrotrón también se pueden utilizar para imágenes de alta resolución μ-CT de insectos fijos y vivos31,55,56,pero son menos accesibles que los escáneres de sobremesa comerciales.
Este protocolo proporciona una forma eficiente de obtener imágenes μ-CT de adultos voladores, pupas, larvas y embriones celularizados. Tenga en cuenta que para muchos de los pasos descritos anteriormente, también se pueden aplicar métodos alternativos para preparar muestras para la obtención de imágenes. Otros estudios han proporcionado una comparación detallada de los diferentes pasos de fijación, etiquetado y secado para su uso en insectos y se alienta a los interesados en adoptar esta técnica a evaluar los méritos de cada enfoque1,4,13,29,30,57. Si bien este protocolo es relativamente sencillo, se presentan algunas sugerencias útiles.
Primero, se debe tener cuidado al interrumpir la cutícula de especímenes intactos de modo que los tejidos blandos subyacentes no se interrumpan significativamente. Es importante dejar que las etapas larvales y tempranas de la pupa se sometan a fijación durante 2 horas en la solución de Bouin antes de pinchar. Esto endurecerá el tejido y limitará la cantidad de hemolinfa que saldrá de los orificios de la cutícula, lo que puede alterar la arquitectura del órgano. Los segmentos corporales individuales (cabeza, tórax y abdomen) del adulto se pueden separar si la estructura (s) de interés se encuentra allí. Se recomienda usar un bisturí para cortar limpiamente estos segmentos en lugar de separarlos con forrceps, lo que podría interrumpir la arquitectura 3D del intestino o el sistema nervioso central, por ejemplo. En cuanto al tiempo, los adultos generalmente necesitan solo 16 horas. para una fijación completa, mientras que las etapas larvales y pupales necesitan 24 h. Además, si la tinción de yodo o PTA parece desigual, la muestra se puede volver a colocar en solución para incubar más tiempo hasta que se logre una tinción uniforme. Finalmente, las muestras hidratadas no deben colocarse a 4 ° C, ya que esto parece inducir la formación de burbujas de aire dentro de la cavidad corporal después del calentamiento a temperatura ambiente.
En segundo lugar, el montaje de la muestra variará según el instrumento, el tipo de etapa y si la muestra necesita permanecer hidratada o si se ha secado en un punto crítico. Si está hidratado, asegúrese de que la muestra no tenga fugas y posiblemente destruya el escáner. Al montar la muestra dentro de una punta de pipeta, asegúrese de empujar suavemente con un objeto opaco hasta que las muestras encuentren una ligera resistencia y no puedan moverse. Empujar demasiado fuerte puede conducir a la deformación de la cutícula y defectos estructurales subyacentes. Además, asegúrese de que la muestra esté alineada en el soporte lo más cerca posible del eje de rotación. Cualquier bamboleo aumentará los tiempos de escaneo debido al mayor campo de visión y reducirá la resolución del tomograma final después de la reconstrucción.
En tercer lugar, la configuración del escáner para adquirir imágenes de proyección también variará según el instrumento. Para maximizar las capacidades de resolución del escáner, el tamaño del punto del haz de rayos X debe ser lo más pequeño posible (5-10 μm). Esto se puede lograr equilibrando el voltaje de rayos X y la configuración de corriente de tal manera que la potencia total sea de 3-4 W. Con estos ajustes y el tiempo de exposición adecuado en la cámara, se puede lograr una atenuación adecuada del haz de rayos X por parte de la muestra y un contraste de imagen óptimo. El uso de filtros de aluminio o cobre entre el objeto y la fuente de rayos X se puede utilizar para ajustar la configuración óptima de energía de rayos X para obtener el mejor contraste de imagen o atenuar el haz lo suficiente para que se utilicen fuentes de mayor potencia. En cuanto a la resolución de la imagen, esto dependerá de muchas variables diferentes, incluido el tipo de mancha, el número de imágenes de proyección, el tamaño del píxel de la imagen, la posición de la cámara, el movimiento de la muestra, las vibraciones del escáner y los parámetros de reconstrucción. Un fantasma de patrón de barras (QRM GmbH) que contiene marcadores de tamaño conocidos puede ayudar a evaluar la resolución espacial para un escáner y una configuración de cámara determinados.
También vale la pena evaluar los méritos de obtener imágenes de muestras secas o hidratadas de puntos críticos. Sombke et al. realizaron una evaluación comparativa de los dos métodos y encontraron que el secado en puntos críticos era superior para aplicaciones de μ-CT que involucraban artrópodos30. Sin embargo, los beneficios de las muestras hidratadas son que los animales están sujetos a una menor exposición química y mecánica que podría conducir a artefactos cuantitativos y morfológicos. Esto también tiende a preservar los tejidos delicados mejor que la CPD. Sin embargo, las muestras hidratadas tienen una vida útil mucho más corta y deben tomarse imágenes a más tardar un mes después de la fijación, ya que la degradación del tejido y la reducción de la calidad de la imagen se vuelven obvias en ese momento. Además, la resolución de las muestras hidratadas será ligeramente inferior a una muestra seca de punto crítico, porque los rayos X también deben penetrar a través de la punta de una pipeta de plástico y el líquido circundante (agua o tampón). Las muestras secas de punto crítico se pueden conservar durante períodos de tiempo mucho más largos, especialmente cuando se mantienen en Drierite. También se pueden colocar directamente en la trayectoria del haz de rayos X simplemente pegando las alas o patas a un pasador de insecto y colocándolo en el mandril del escenario, simplificando el proceso de montaje. Sin embargo, la deshidratación extensa de etanol de estas muestras puede conducir a la contracción del tejido y la pérdida de la delicada arquitectura del tejido, por lo que es importante realizar un rango de concentraciones crecientes de EtOH para minimizar estos efectos. No obstante, debe tenerse en cuenta que todas las formas de tratamiento químico, incluida la fijación de paraformaldehído e incluso la tinción de yodo pueden causar contracción de los tejidos58,59. Si bien ninguno de los métodos proporcionará mediciones del "tamaño real del órgano" en una mosca viva, las mediciones morfométricas siguen siendo válidas cuando se comparan animales mutantes y de tipo salvaje, siempre y cuando los pasos de fijación, tinción y secado se lleven a cabo de manera idéntica para ambos conjuntos de muestras, preferiblemente en paralelo.
En conclusión, μ-CT proporciona una herramienta útil de imágenes animales completas para Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Muchos otros estudios han demostrado el poder de esta tecnología para comprender diversos aspectos de la taxonomía de insectos, la ecología, la fisiología, el desarrollo y la anatomía que pueden ayudar a informar futuros estudiosen moscas1,28,30,31,32,55,56,57 . Combinado con las herramientas genéticas y de microscopía de luz ya ampliamente utilizadas en este organismo, μ-CT puede posicionarse dentro de una tubería experimental que permite una comprensión más profunda entre el genotipo y el fenotipo.

Los métodos de imágenes que permiten la investigación detallada de las estructuras interiores de un objeto sin destruir su arquitectura 3D general han demostrado ser ampliamente beneficiosos para una serie de disciplinas diferentes, incluidas la física, la ingeniería, la ciencia de los materiales, la arqueología, la paleontología, la geologíay la biología1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Entre estos métodos de imágenes no destructivas, las plataformas basadas en rayos X son especialmente útiles debido a la capacidad de los rayos X de alta energía para penetrar en muchos tipos de muestras y materiales diferentes con una dispersión mínima en comparación con las ondas de luz visible. La tomografía computarizada (TC), la tomografía microcomputada (μ-CT), la tomografía nanocomputada (Nano-CT) y la microtomografía sincrotrón han surgido, por lo tanto, como las tecnologías primarias para la obtención de imágenes basadas en rayos X de muestras que van desde metros hasta micras, con capacidades de resolución milimétricas asubmiónimas 10,11,12,13,14.
Si bien estas plataformas difieren en su diseño, geometría de rayos X y componentes para equilibrar el tamaño y la resolución de la muestra, todas se basan en el mismo principio básico para la captura de imágenes: una fuente de rayos X que viajan a través del objeto y son capturados por un detector. La atenuación diferencial del haz de rayos X a medida que pasa a través de diferentes densidades dentro del objeto genera contraste de imagen. Los datos 3D se obtienen girando la muestra o el detector, recogiendo una serie de imágenes de proyección 2D que luego se reconstruyen utilizando algoritmos en tomogramas que contienen información 3D cuya resolución es isotrópica en x,y,z15. Para muchos escáneres de μ-CT de sobremesa que utilizan una geometría de rayos X de haz cónico para proyectar rayos X en el objeto que se está fotografiado, el algoritmo de Feldkamp se utiliza para reconstruir con precisión el objeto con errores mínimos16.
La resolución de una plataforma dada está determinada principalmente por parámetros del sistema, como el tamaño del haz de rayos X (tamaño del punto), la geometría del escáner (distancia del objeto a la fuente de rayos X), el tamaño de los píxeles en el detector y el algoritmo de reconstrucción empleado. Factores adicionales, como las vibraciones del escáner, las fluctuaciones del haz de rayos X, el movimiento de la muestra y el tipo de material o la mancha química utilizada para visualizar el objeto también pueden influir significativamente en la resolución espacial bajo condiciones de imágenes del mundo real15.
Para aplicaciones biomédicas, la TC y la μ-CT han desempeñado un papel clave en el avance de nuestra comprensión de la anatomía, la fisiología, el desarrollo y los mecanismos de la enfermedad, sirviendo como una herramienta tanto para el diagnóstico de pacientes humanos como como una plataforma de imágenes preclínicas para organismos modelo17,18. Por ejemplo, el Mouse International Phenotyping Consortium, cuyo objetivo es identificar la función de cada gen en el genoma del ratón, utiliza μ-CT como parte de su tubería de fenotipado19. Sus resultados han sido críticos para comprender los genes involucrados en el desarrollo y los procesos de la enfermedad, al tiempo que sirven como un atlas para la anatomía y el desarrollo delratón 20. Otros organismos modelo, como el pez cebra y las ratas, también han adoptado plenamente el uso de μ-CT para realizar fenotipos animales completos de una serie de mutantes genéticos17,21,22,23.
La ventaja de combinar imágenes de animales enteros con organismos modelo es que se puede explorar completamente una comprensión mecanicista de la función génica para un proceso biológico dado. Esto es posible debido a los genomas bien caracterizados y muchas herramientas genéticas disponibles en los organismos modelo que permiten la manipulación precisa de la función génica en distintos puntos de tiempo de desarrollo, tejidos específicos, células individuales e incluso orgánulos subcelulares. Estos incluyen sistemas de expresión binaria como el sistema UAS / GAL4 (y sus muchos derivados), CRISPR / Cas9 y RNAi24,25,26. Cuando estas herramientas genéticas se utilizan junto con una poderosa tubería de imágenes que consiste en microscopía electrónica, microscopía de luz (fluorescente y no fluorescente) e imágenes de animales completos como μ-CT, se puede lograr una evaluación exhaustiva de moléculas, células, tejidos, órganos y todo el organismo, lo que permite una comprensión mucho más profunda de la función génica.
Este protocolo se centra en el uso de μ-CT en el organismo modelo no mamífero Drosophila melanogaster, cuya miríada de herramientas genéticas han ayudado a dilucidar numerosos mecanismos moleculares26,27. Fue adoptado a partir de protocolos anteriores en insectos no modelo1,28,29,30,31,32,y se basa en estudios previos de μ-CT en Drosophila para establecer un protocolo estandarizado para su uso en este animal33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Se describen los pasos para la preparación exitosa de muestras, imágenes y análisis de conjuntos de datos de mosca μ-CT utilizando escáneres disponibles comercialmente. Con este protocolo, todas las etapas de desarrollo de la mosca se pueden visualizar a alta resolución para estudios descriptivos y de prueba de hipótesis, incluyendo taxonomía, anatomía, desarrollo, fisiología y enfermedad27. Este protocolo también será útil para obtener imágenes de prácticamente cualquier insecto e incluso materiales no vivos que requieran tinción química para el contraste de imágenes para mejorar la visualización mediante μ-CT.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>For critical point drying</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>For animal fixation</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td></td><td></td><td>Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>For microfuge tubes</td></tr><tr><td>Image Analysis Workstation</td><td></td><td></td><td>Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering</td></tr><tr><td>Iodine Solution (I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 &amp;micro;m pixel size.</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>For poking hole in cuticle</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry</td></tr><tr><td>P10 pipet tips</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Sample mounting</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Dilute to 1X with water before use</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>For staining</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>For Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)</td></tr><tr><td>X-Ray Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD&amp;trade;)</td></tr></tbody></table>

whole animal imaging of drosophila melanogaster using microcomputed tomography

Las herramientas de imágenes biomédicas permiten la investigación de mecanismos moleculares a través de escalas espaciales, desde genes hasta organismos. Drosophila melanogaster, un organismo modelo bien caracterizado, se ha beneficiado del uso de la luz y la microscopía electrónica para comprender la función génica a nivel de células y tejidos. La aplicación de plataformas de imágenes que permiten una comprensión de la función de los genes a nivel de todo el organismo intacto mejoraría aún más nuestro conocimiento de los mecanismos genéticos. Aquí se presenta un método completo de imágenes animales que describe los pasos necesarios para visualizar Drosophila en cualquier etapa del desarrollo utilizando tomografía microcomputadora (μ-CT). Las ventajas de μ-CT incluyen instrumentación disponible comercialmente y un tiempo práctico mínimo para producir información 3D precisa a una resolución de nivel micrones sin la necesidad de métodos de disección o limpieza de tejidos. Junto con el software que acelera el análisis de imágenes y la representación 3D, se puede realizar un análisis morfométrico detallado de cualquier sistema de tejidos u órganos para comprender mejor los mecanismos de desarrollo, fisiología y anatomía para estudios de pruebas descriptivas e hipótesis. Al utilizar un flujo de trabajo de imágenes que incorpora el uso de microscopía electrónica, microscopía de luz y μ-CT, se puede realizar una evaluación exhaustiva de la función del gen, lo que aumenta la utilidad de este poderoso organismo modelo.

La Figura 2 muestra imágenes de un embrión, 3ª larva instar, pupas en la etapa adulta de pharate (P7) y una mosca hembra adulta teñida con yodo y fotografiada hidratada en agua utilizando un escáner de sobremesa comercial. La excelente conservación e incluso la tinción de tejidos delicados son evidentes, lo que permite que todos los órganos principales se identifiquen fácilmente y se utilicen para el análisis morfométrico y la visualización 3D.
Por lo general, los escaneos que adquieren menos imágenes de proyección de la muestra proporcionan una resolución más baja que los escaneos que adquieren más imágenes de proyección, con la compensación de tiempo dedicado al escaneo. Aunque los tiempos de escaneo variarán según el instrumento y otros parámetros de escaneo, los escaneos que adquieren unos pocos cientos de proyecciones (~ 3 μm de tamaño de píxel de imagen) toman aproximadamente 30 minutos por espécimen, mientras que los escaneos que consisten en miles de imágenes de proyección (tamaño de píxel de imagen de 700 nm-1.25 μm) pueden tomar de 8 a 16 h. En la Figura 3se muestra una comparación de la misma carcasa de la cabeza de la mosca adulta tomada en modo de escaneo "lento" (miles de proyecciones) y "rápido" (cientos de proyecciones). Es importante destacar que los análisis morfométricos no difieren entre escaneos "lentos" y "rápidos"(Figura 3C)40. Nuestra tubería de imágenes, por lo tanto, utiliza escaneos rápidos para generar un tamaño de muestra suficientemente grande para el análisis morfométrico, y escaneos lentos para visualizar cualquier defecto morfológico o anatómico a mayor resolución. Usando el software (Paso 7), cualquier sistema de tejido u órgano de interés puede ser segmentado y utilizado para el análisis morfométrico y visualizado en 3D utilizando el creador de películas (Película 1).
La Figura 4 muestra un ejemplo del abdomen de la mosca teñido con PTA y fotografiado hidratado (agua) o después del secado en punto crítico (CPD) en un microscopio de rayos X (Tabla de Materiales). El detalle que ofrece una combinación de la PTA y las capacidades de esta plataforma es fácilmente evidente en estas imágenes, de modo que las células epitelios individuales del intestino medio y los haces de espermatozoides dentro de los testículos se resuelven fácilmente. Mientras que la imagen CPD muestra una resolución ligeramente mayor en comparación con la muestra hidratada, se logra una mejor preservación de la ultraestructura de los tejidos delicados (como las células grasas cerca de la cutícula) con muestras hidratadas(Película 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del diseño del escáner y el montaje de muestras para μ-CT. (A) Un escáner comercial de sobremesa μ-CT. (B) Vista dentro del escáner. La fuente de rayos X (derecha) emite rayos X que pasan a través de la muestra ubicada en una etapa giratoria (flecha amarilla). La atenuación de estos rayos X genera contraste de imagen a medida que pasan a través de la muestra y hacia el detector, que consiste en una pantalla de centelleo que convierte los rayos X en fotones y una cámara CCD estándar (izquierda). (C) Montaje de una mosca de la fruta adulta para imágenes hidratadas en agua. Los puntos de conexión entre la punta de la pipeta y el soporte de latón están envueltos en película de parafina para evitar fugas y posibles daños al escáner. También se destaca el chuck del escenario. Tenga en cuenta que la punta de la pipeta se colocó ligeramente fuera del eje, lo que condujo a un tiempo de escaneo más largo y una resolución reducida en la reconstrucción final. (D) Una sola imagen de proyección 2D de una mosca hembra adulta; cientos o miles de estas proyecciones se adquieren durante un escaneo a lo largo del eje de rotación y se utilizan para la reconstrucción para generar tomogramas que contienen resolución isotrópica e información 3D precisa. Barras de escala (C) = 2 mm. P, posterior; V, Ventral. Esta cifra ha sido modificada a partir de Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Figura 2: Todas las etapas del ciclo de vida de Drosophila melanogaster, fotografiadas por μ-CT. Muestras teñidas con yodo y fotografiadas hidratadas en agua. Se muestra un solo segmento 2D. (A) Un embrión que ha completado las primeras etapas de la gastrulación (asterisco). (B) Una tercera larva instar. (C) Un adulto farato P7 durante la metamorfosis. (D) Una hembra adulta. Se destacan varios órganos: BWM, músculos de la pared del cuerpo; Br, cerebro; Cd, cardia; Cr, cultivo; DLT: músculos longitudinales dorsales; DVM: músculos ventrales dorsales; E-AD: disco ojo-antenal; Em, embrión; FB, cuerpos gordos; FBCs, células grasas del cuerpo; H, corazón; Hg, intestino posterior; La, lámina; L, pierna; Mg, intestino medio; OL: lóbulo óptico cerebral; Ov, ovipositor; PC, cutícula pupal; SG: glándulas salivales; VNC: cordón nervioso ventral; W, ala; WD, disco alar. Barras de escala (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Anterior; L, izquierda. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Tamaño de píxel de la cámara (μm): (A-D) 11.6. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Figura 3: Los parámetros de escaneo y la resolución de la imagen no alteran los análisis morfométricos. Una cabeza adulta escaneada utilizando tanto la configuración "rápida"delescáner (cientos de proyecciones) como la configuración del escáner(B, B)"lenta" (miles de proyecciones). El cerebro está delineado en amarillo. (C) Mediciones del volumen cerebral a partir de exploraciones lentas y rápidas. Estructuras destacadas: AL; lóbulo antenal; CB: cerebro central; FB, cuerpo en forma de abanico; FCs, células grasas; La, lámina; Lo, lobula; LoP, placa lobula; Yo, médula; Re, retina. n = 5, prueba t de Welch. ns = no significativo. Barras de escala = 100 μm. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A) 348 (B) 350. Tamaño de píxel de la cámara (μm): (A-B) 11.6. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A) 2.95, (B) 1.2. Esta cifra ha sido modificada a partir de Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Figura 4: Abdomen de Drosophila melanogaster fotografiado por microscopía de rayos X. Los abdomen se tiñeron con 0,5% de PTA y se les hidrató la imagen (agua) o después del secado en puntos críticos (CPD). (A) Punto crítico Abdomen seco, mostrado desde la perspectiva YZ y (A') XZ perspectiva. (B) Abdomen hidratado, mostrado desde la perspectiva YZ y (B') perspectiva XZ. Se destacan varios órganos: FC, células grasas; Hg, intestino posterior; Mg, Midgut; SP: Bomba de esperma; Te, Testículos. Barras de escala (A) = 250 μm. D, dorsal; A, Anterior; L, izquierda. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película 1: Una tercera larva instar, renderizada en 3D usando el Movie Maker en Dragonfly. Los órganos destacados incluyen el cerebro (amarillo), los discos imaginales oculares-antenales (rojo), el cuerpo graso (azul) y los músculos de la pared del cuerpo (verde). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 2: Comparación de muestras fotografiada en agua o después del secado en punto crítico. Se muestran abdomen teñidos con 0,5% de PTA. Ambos abdomen se escanearon con idénticos ajustes de tamaño de píxel de imagen (0,65 μm). Una serie de cortes 2D se muestran en un formato 'Z-stack' (YZ) que comienza en la superficie dorsal y termina en la superficie ventral del abdomen. Órganos destacados: FC, células grasas; Mg, Midgut; SP: Bomba de esperma; Te, Testículos. Parámetros de escaneo: Distancia de fuente a muestra (mm): (A) 6.7, (B) 7. Distancia de la fuente a la cámara (mm): (A) 28 (B) 29.5. Objetivo: (A-B) 4X. Tamaño de píxel de imagen (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

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Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Se presenta un protocolo que permite la visualización de Drosophila melanogaster intacta en cualquier etapa de desarrollo mediante tomografía microinformada.

Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

4.8K vistas.  University of Wyoming. Se presenta un protocolo que permite la visualización de Drosophila melanogaster intacta en cualquier etapa de desarrollo mediante tomografía microinformada.

Video: Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Investigación

Biología

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Biología del Desarrollo

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida fijación de fijo y manchados, todo, escala milimétrica muestras para histología sin sección 3D de tomografía Micro computada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioingeniería

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurociencias

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparación de Drosophila melanogaster adulto para imágenes cerebrales completas durante las respuestas de comportamiento y estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique cristae-rich double membrane ultrastructure of this organelle is elegantly arranged to carry out multiple functions by partitioning biomolecules. Mitochondrial ultrastructure is intimately linked with various functions; however, the fine details of these structure-function relationships are only beginning to be described. Here, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle. Serial-section electron tomography may be adapted to study any cellular structure in three-dimensions.

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

In this protocol, we demonstrate the application of serial-section electron tomography to elucidate mitochondrial structure in Drosophila indirect flight muscle.

3D ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila revelado por tomografía electrónica serie-sección

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

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