En este protocolo, demostramos un procedimiento eficaz para fabricar microesferas porosas altamente abiertas basadas en PLGA, que ofrecen varias ventajas, como la comodidad de las células de embalaje, la mejora de la retención celular y la mínima invasividad. Las microesferas porosas altamente abiertas monodispersas resultantes basadas en PLGA poseían tamaños de partículas de aproximadamente 400 micrómetros y poros abiertos de aproximadamente 50 micrómetros con ventanas interconectadas para mejorar la eficacia de la retención celular. Estos microportadores mínimamente invasivos pueden soportar una plataforma de un intrincado modelo tumoral 3D para la detección de fármacos y herramientas fáciles para construir microtejidos cargados de células para la regeneración de tejidos.
Este enfoque es bastante fácil, ya que el dispositivo microfluídico se puede ensamblar a partir de tubos de cloruro de polivinilo, un capilar de vidrio y una aguja. Demostrando el procedimiento estará Sheng-Chang Luo, un estudiante de doctorado en el laboratorio. Comience construyendo un generador microfluídico de coflujo utilizando un capilar de vidrio, tubos de cloruro de polivinilo y una aguja dispensadora de calibre 26.
Luego conecte el capilar de vidrio al extremo del tubo de cloruro de polivinilo y perfore la conexión entre los dos con una aguja. Para la generación de gotas, coloque el otro extremo del tubo de cloruro de polivinilo en la fase continua y cure con el pegamento ultravioleta para sellar los espacios en la articulación. Ahora tome una jeringa de 50 mililitros para cargar la fase continua y una jeringa de cinco mililitros para la formación de emulsión.
Luego establezca las tasas de flujo de la fase continua en dos mililitros por minuto y las fases de dispersión en 0.08 mililitros por minuto. Coloque un vaso de precipitados de 500 mililitros en un baño de hielo y llénelo con una solución acuosa de alcohol polivinílico preenfriada. Para preparar la emulsión, decantar inmediatamente la solución acuosa de gelatina en la solución DCM de PLGA y emulsionar con el dispositivo ultrasónico.
Luego ajuste la potencia ultrasónica a 400 vatios, y el tiempo total de procesamiento a 90 segundos, y cambie constantemente la posición de la sonda manualmente. Estabilice la emulsión resultante para la succión de la jeringa y la generación de gotas en aproximadamente 20 minutos. Después del tratamiento ultrasónico, cargue rápidamente la emulsión preparada en la jeringa de cinco mililitros en la plataforma microfluídica e introduzca la emulsión inestable de aceite de agua en el dispositivo microfluídico como fase discontinua.
Simultáneamente, use la solución acuosa de alcohol polivinílico como fase continua. Después de inyectar porciones adecuadas de la emulsión en el dispositivo microfluídico, recoja la microesfera que contiene la emulsión en la parte inferior del vaso de precipitados colector y coloque la muestra a cuatro grados centígrados durante la noche para una mayor estabilización. Normalice las microesferas almacenadas a temperatura ambiente y elimine el DCM residual agitando con una varilla de vidrio durante una hora a 60 RPM.
Luego, decantar cuidadosamente la fase de recolección en un vaso de precipitados de 500 mililitros y lavar el alcohol polivinílico residual de la superficie de las microesferas porosas con agua desionizada tres veces. Disuelva la gelatina envuelta en la columna vertebral de PLGA colocando las microesferas de PLGA en el baño maría a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego retire la gelatina residual enjuagando las microesferas resultantes con el agua desionizada dos veces, y enfríe previamente para la liofilización a menos 80 grados centígrados durante 24 horas.
Las microesferas porosas altamente abiertas basadas en PLGA mostraron tamaños de 350 a 500 micrómetros con un poro de tamaño arbitrario de 10 a 100 micrómetros, y ventanas interconectadas, lo que podría facilitar una alta eficiencia en el transporte de desechos metabólicos de oxígeno. Las células madre mesenquimales de médula ósea cultivadas dentro de las microesferas porosas altamente abiertas basadas en PLGA se adhirieron a los andamios en un día, lo que representa una amplia capacidad de adhesión y migración de las células. La tinción de calcio-AM y yoduro de propidio mostró que las células están vivas y distribuidas uniformemente.
Es esencial establecer la potencia ultrasónica y la posición de la sonda. La producción reproducible de microesferas porosas altamente abiertas basadas en PLGA allanará el camino para construir gráficos listos para inducir la regeneración o la detección de drogas.
