In questo protocollo, dimostriamo una procedura efficace per la fabbricazione di microsfere porose altamente aperte basate su PLGA, che offrono diversi vantaggi come la praticità delle celle di imballaggio, una migliore ritenzione cellulare e una minima invasività. Le microsfere porose monodisperse ad alta apertura basate su PLGA risultanti possedevano dimensioni delle particelle di circa 400 micrometri e pori aperti di circa 50 micrometri con finestre interconnesse per una migliore efficacia di ritenzione cellulare. Questi microcarrier minimamente invasivi possono supportare una piattaforma di un intricato modello tumorale 3D per lo screening dei farmaci e strumenti facili per costruire micro tessuti carichi di cellule per la rigenerazione dei tessuti.
Questo approccio è abbastanza semplice, in quanto il dispositivo microfluidico può essere assemblato da tubi di cloruro di polivinile, un capillare di vetro e un ago. A dimostrare la procedura sarà Sheng-Chang Luo, uno studente di dottorato in laboratorio. Inizia costruendo un generatore microfluidico a flusso co-flow usando un capillare di vetro, tubi di cloruro di polivinile e un ago di erogazione calibro 26.
Quindi collegare il capillare di vetro all'estremità del tubo di cloruro di polivinile e perforare la connessione tra i due con un ago. Per la generazione di gocce, posizionare l'altra estremità del tubo di cloruro di polivinile nella fase continua e polimerizzare con la colla ultravioletta per sigillare gli spazi sul giunto. Ora prendi una siringa da 50 millilitri per caricare la fase continua e una siringa da cinque millilitri per la formazione dell'emulsione.
Quindi impostare le portate della fase continua a due millilitri al minuto e le fasi di dispersione a 0,08 millilitri al minuto. Posizionare un becher da 500 millilitri in un bagno di ghiaccio e riempirlo con una soluzione acquosa di alcol polivinilico pre-raffreddata. Per preparare l'emulsione, decantare immediatamente la soluzione acquosa di gelatina nella soluzione DCM di PLGA ed emulsionare utilizzando il dispositivo ad ultrasuoni.
Quindi regolare la potenza ultrasonica a 400 watt e il tempo di elaborazione totale a 90 secondi e modificare costantemente la posizione della sonda manualmente. Stabilizzare l'emulsione risultante per l'aspirazione della siringa e la generazione di goccioline in circa 20 minuti. Dopo il trattamento ad ultrasuoni, caricare rapidamente l'emulsione preparata nella siringa da cinque millilitri nella piattaforma microfluidica e introdurre l'emulsione di olio d'acqua instabile nel dispositivo microfluidico come fase discontinua.
Contemporaneamente, utilizzare la soluzione acquosa di alcol polivinilico come fase continua. Dopo aver iniettato le porzioni appropriate dell'emulsione nel dispositivo microfluidico, raccogliere la microsfera contenente l'emulsione sul fondo del becher di raccolta e posizionare il campione a quattro gradi Celsius durante la notte per un'ulteriore stabilizzazione. Normalizzare le microsfere immagazzinate a temperatura ambiente ed eliminare il DCM residuo agitando con una bacchetta di vetro per un'ora a 60 RPM.
Quindi, decantare accuratamente la fase di raccolta in un becher da 500 millilitri e lavare via l'alcol polivinilico residuo dalla superficie delle microsfere porose con acqua deionizzata tre volte. Sciogliere la gelatina avvolta nella spina dorsale del PLGA posizionando le microsfere PLGA nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi rimuovere la gelatina residua risciacquando due volte le microsfere risultanti con l'acqua deionizzata e pre-raffreddare per la liofilizzazione a meno 80 gradi Celsius per 24 ore.
Le microsfere porose altamente aperte basate su PLGA mostravano dimensioni da 350 a 500 micrometri con un poro di dimensioni arbitrarie da 10 a 100 micrometri e finestre interconnesse, che potrebbero facilitare un'elevata efficienza nel trasporto di rifiuti metabolici di ossigeno. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo coltivate all'interno delle microsfere porose altamente aperte a base di PLGA hanno aderito agli scaffold in un giorno, rappresentando ampie capacità di adesione e migrazione delle cellule. La colorazione con ioduro di calcio-AM e propidio ha mostrato che le cellule sono vive e distribuite uniformemente.
È essenziale impostare la potenza ultrasonica e la posizione della sonda. La produzione riproducibile di microsfere porose altamente aperte basate su PLGA aprirà la strada alla costruzione di grafici pronti all'uso per indurre la rigenerazione o lo screening dei farmaci.
