Damos las gracias a S. Arber para los ratones mGFP ya los miembros del laboratorio de Zervas que leer críticamente el papel y brindó asistencia técnica. A. Brown fue apoyado por una concesión de Ciencias del Cerebro de Verano de Investigación de Posgrado Kaplan. E. Normand fue apoyada por una ciencia del cerebro Premio de Investigación del Programa Graduado. Esta investigación también fue financiada por los fondos de investigación de inicio (MZ).

El tamoxifeno Preparación y Procedimiento sonda nasogástrica (E8.5) <ul><li> Preparar a 20 mg / ml de solución stock de tamoxifeno por disolución de tamoxifeno en el aceite de maíz pre-calentado. </li><li> Incubar la solución a 37 ° C durante 2 horas en un nutator y agitar de forma intermitente. </li><li> Proteger a la población de la luz con tamoxifeno, se almacenan a 4 ° C, y el uso de hasta un mes. </li><li> Para los experimentos de mapeo de destino, establecer un par de crianza que consiste en una hembra Swiss Webster (de tipo salvaje, compró de Taconic) y un macho lleva a la vez un gen específico CREER alelo T y un alelo reportero. Para fines de demostración, estamos usando Wnt1-Creer T; hombres mGFP (Ellisor 2009). </li><li> Compruebe suizo hembras Webster cada mañana por la aparición de un tapón vaginal. Designar a la mañana (0900) del día se ve un tapón vaginal como 0,5 días post-coito y calcular la fecha de administración de tamoxifeno sobre la base de este punto de partida. (Para este experimento, el día embrionario 8.5 se utilizó). </li><li> Use una jeringa de 1 ml con una aguja de alimentación de los animales (20 G x 1-1/2) para elaborar 200 l de la solución madre de tamoxifeno (4 mg tamoxifeno). </li><li> Firmemente limitar el tiempo del embarazo suizos Webster mujer agarrando la nuca del cuello y la espalda para inmovilizar la cabeza y vuelta para el lado ventral hacia arriba. </li><li> Mantenga la cola entre los dedos libres para mantener el cuerpo en una línea recta. </li><li> Coloque la aguja de alimentación en la esquina de la boca y guiar la aguja a lo largo del techo de la boca. </li><li> Gire la aguja de modo que quede paralela al cuerpo, al mismo tiempo que se inclina la cabeza hacia atrás para mantener el cuello recto. </li><li> Guiar la aguja a través del esófago hacia el estómago. Tenga cuidado de no entrar en la tráquea. Si hay resistencia a la aguja, se dedica al animal reflejo nauseoso, o si el ratón luchas, retire inmediatamente la aguja y tratar la sonda de nuevo. </li><li> Una vez que la aguja de alimentación está en el estómago, administrar el tamoxifeno en el estómago y el retorno a la hembra a su jaula hasta la fecha de la disección. </li></ul> Craneotomía: <ul><li> Intracardial perfundir el destino asignado para adultos ratón con 4% PFA y quitar de la cabeza con unas tijeras cortando a través de la columna vertebral justo por encima de los hombros. </li><li> Ejecutar un bisturí a lo largo de la línea media dorsal de la cabeza (rostral a caudal) para cortar el cuero cabelludo y exponer el cráneo. </li><li> Utilizando el bisturí, raspar el exceso de tejido o músculo de largo del lado y posterior del cráneo. </li><li> Con unas pinzas, perforar el cráneo en la línea media, justo rostral al bulbo olfativo y crear un pequeño agujero para dar cabida a la punta de unas tijeras finas. </li><li> Introduzca las tijeras finas en este agujero y hacer una incisión medial a lateral aproximadamente de la longitud de los bulbos olfatorios. Este corte se rompió el cráneo en la intersección de los huesos de la nariz y el hueso frontal y proporcionar un buen acceso a las tijeras. </li><li> Corte a lo largo de la sutura sagital en el cráneo (dorsal línea media), asegurándose de mantener la puntas de las tijeras en ángulo lejos del cerebro para evitar dañar el tejido subyacente. </li><li> Pellizque suavemente la cabeza con unas pinzas y retire el hueso largo de la incisión medial para exponer el cerebro. El cráneo puede saltar en pedazos pequeños o separarse en secciones más grandes. Seguir utilizando las pinzas para quitar todos los huesos frontal, parietal, interparietal y occipital. </li><li> Romper los huesos que encierra la paraflocculi (que se encuentra a lo largo de los bordes laterales del cerebro a nivel del cerebelo) apretando los huesos esféricas a cada lado. Tire suavemente lejos los huesos. </li><li> Gire la cabeza hacia abajo (lado dorsal hacia abajo) y el uso de las pinzas para cortar los nervios craneales y la liberación del cerebro en el cráneo. </li></ul> Microscopía todo el monte: cerebrales en adultos <ul><li> Evaluar el cerebro adulto de la GFP se utiliza un microscopio marca fluorescente de disección. </li><li> Transferencia de cerebros a un plato de Petri con PBS y la fotografía usando PictureFrame o el software apropiado. </li></ul> Microscopía todo el monte: E12.5 embriones <ul><li> Evaluar embriones todo el montaje de las buenas prácticas agrarias marca se utiliza una sonda fluorescente de disección. </li><li> Transferencia de las buenas prácticas agrarias que son positivos por el montaje de todo a un plato de Petri con PBS y la fotografía usando PictureFrame o el software apropiado. </li><li> El uso de fórceps para desprender una pequeña porción de la cola de cada embrión, colocar cada pieza en un tubo de PCR y el genotipo de los tejidos mediante PCR (Ellisor 2009) para los dos alelos para confirmar los resultados observados a través del análisis conjunto de montaje. </li></ul> Micro-disección y preparación de los explantes de mesencéfalo ventral de E12.5 embriones <ul><li> Después de la disección de la cadena del útero y la identificaciónentification de asignar el destino de embriones por todo el montaje de fluorescencia, los embriones de transferencia de helado de PBS estéril en una placa de cultivo celular. </li><li> Usando tijeras finas, eliminar la parte de la cabeza del embrión de corte transversal, caudal de rhombomere 1. </li><li> A continuación, retire la porción rostral de la cabeza con un corte coronal a través del diencéfalo. Esto expondrá una estructura similar a un tubo en el que el ventrículo cuarto a través de la forma de la vesícula mesencefálica un conducto entre los tejidos dorsal y ventral. </li><li> Con cuidado, inserte la punta de tijera en el ventrículo cuarto, y cortar a lo largo de la línea media dorsal, caudal a rostral, la apertura total del tubo, la creación de un &quot;libro abierto&quot; de preparación. El mesencéfalo ventral ahora estarán expuestos medial, mientras que las dos mitades dorsal del mesencéfalo se encuentran lateralmente. </li><li> Eliminar cualquier resto de tejido neural no por debajo del mesencéfalo ventral para que el tejido a poner más rotundamente. Si es necesario, hacer muescas en los aspectos rostral y caudal de tal manera que el dorsal &quot;alas&quot; del explante se tumbó también. El explante de ahora debe ser similar a una mariposa &quot;, en la que el mesencéfalo dorsal representa las alas, y un rhombomere la cola. </li><li> A fin de aislar el mesencéfalo ventral para el análisis de FACS o experimentos de cultivo celular, quitar el lateral (cara dorsal) del tejido. </li></ul> Los resultados representativos: En este experimento GIFM, Wnt1 células que expresan de forma permanente y durante la embriogénesis heritably marcados por la administración de tamoxifeno a E8.5 a Wnt1-CreERT; embriones mGFP. Posteriormente, estas células marcadas se visualizan a través de toda la fluorescencia de montaje e inmunohistoquímica sección para determinar cómo Wnt1 células derivadas de contribuir al desarrollo a través de las estructuras nerviosas. Toda la fluorescencia de montaje se basa en el componente de la membrana GFP obligado de la periodista mGFP y por lo tanto proporciona información celular, así como una visión general de Wnt1 derivados de las proyecciones neuronales. Por ejemplo, con la administración de tamoxifeno a E8.5, Wnt1-CreERTmGFP embriones en E12.5 fluorescencia de GFP muestran principalmente en el mesencéfalo, rombencéfalo posterior y la médula espinal (Figura 1). A mayor aumento, bien proyecciones neuronales se ven que inervan el cerebro medio, la pared del cuerpo, las extremidades y la región craneofacial. En esta etapa de desarrollo, el embrión es translúcido y etiquetado de las buenas prácticas agrarias interna es fácil de discernir. Sin embargo, como el cerebro se desarrolla, la densidad de los tejidos maduros oscurece fluorescencia de GFP que emanan de las estructuras cerebrales internas. Por lo tanto, con la administración de tamoxifeno a E8.5, sólo las buenas prácticas agrarias de etiquetado menor se observa en el colículo superior de los adultos por toda la fluorescencia de montaje (Figura 1C, recuadro). Además, algunas proyecciones axonales se ven circulando por la superficie ventral del cerebro posterior (no mostrado). En contraste, cuando se administra tamoxifeno en E9.5, etiquetado GFP sustancial se produce en todo el colículo todo inferior (fig. 1B, recuadro). Este aumento en toda la fluorescencia de montaje puede indicar que Wnt1 células que expresan en E9.5 contribuir más significativamente a las regiones superficiales del cerebro medio dorsal o ampliar más los procesos dentro de esta región que Wnt1 células que expresan de E8.5. De todos modos, esta diferencia en el conjunto de fluorescencia montaje refleja la naturaleza dinámica de Wnt1 expresión durante el desarrollo y demuestra cómo GIFM se puede utilizar para seguir las distintas poblaciones de células del embrión en el adulto maduro. Con técnicas de inmunohistoquímica, las secciones de tejido destino asignado a partir de Wnt1-CreERT; animales mGFP se analizan a nivel celular. Los anticuerpos contra la GFP y β-galactosidasa (β-gal) se utilizan en combinación con una variedad de biomarcadores específicos de tejido para determinar la contribución a escala fina celular del linaje Wnt1 a las estructuras neuronales y tipos de células. Con la administración de tamoxifeno a E8.5 y análisis de tejidos a E12.5, doble células positivas (GFP + y β-gal +) se observan en todo el cerebro medio y cerebro posterior con las proyecciones de correr por el cerebro medio ventral (fig. 1B). En el cerebro adulto, el Wnt1 linaje marcado en E8.5 da lugar a estructuras del cerebro medio incluyendo muchos los tubérculos cuadrigéminos superiores e inferiores, así como en las cercanías de las poblaciones de células dopaminérgicas del área tegmental ventral y la sustancia negra (Figura 1 D) (véase También Zervas 2004). En contraste, el linaje Wnt1 marcado en E9.5 da lugar a colículo inferior, así como a las neuronas en las cercanías de las poblaciones de células dopaminérgicas (Figura 1 F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Los resultados representativos para el mapeo de Wnt1-destino.: Ejemplos de todo el montaje y los resultados de inmunocitoquímica en Wnt1-CreERT; embriones mGFP y el destino de los cerebros adultos mapa (marcado) a E8.5 (AD)y E9.5 (EF). A. Wnt 1-Creer; mGFP embriones en E12.5 fluorescencia de GFP muestran principalmente en el cerebro medio (Mb), parte posterior del cerebro posterior (Hb) y la médula espinal (Sp). Las células B. Marcado visualizar y analizar a nivel celular mediante técnicas de inmunohistoquímica, como se muestra en este 1-m de espesor óptico de la sección (objetivo de 40x, la serie Z de adquisición). Nuclear β-galactosidasa (nβ-gal) el etiquetado de anticuerpos (rojo) y el etiquetado de anticuerpos GFP (verde) indica que asigna el destino de las células se muestra en el cerebro medio ventral. Aquí, las células recombinadas son doble positivo (nβ-gal + / GFP +) debido a la naturaleza de la periodista mGFP condicional. C. Todo el montaje de microscopía de fluorescencia revela tenue fluorescencia de GFP en el colículo superior, (SC) de los adultos (recuadro). Evaluar el linaje Wnt1 marcado en E8.5 en las secciones para adultos con bajo aumento (5 veces) microscopía revela que el linaje Wnt1 da lugar a estructuras del cerebro medio como el superior (SC) e inferior (IC) colículo (C). D. A 40x, 1 mm óptica sección tomada desde el cerebro medio ventral en la vecindad de las neuronas dopaminérgicas con células gal nβ-GFP + y un rico plexo axonal +. E. Marcado de los resultados E9.5 en el etiquetado de las buenas prácticas agrarias importante que se observa fácilmente en el colículo inferior del cerebro medio por toda la fluorescencia de montaje (recuadro). El linaje Wnt1 marcado en E9.5 en las secciones para adultos (β-gal +, rojo) se concentra en el colículo inferior (dorsal-posterior del cerebro medio) como se ve con bajo aumento (5 veces) microscopía (E). F. A 40x, 1 mm de sección óptica tomada del cerebro medio ventral en la vecindad de las neuronas dopaminérgicas con células gal nβ-GFP + y un rico plexo axonal +. Wnt1 neuronas derivadas de marcado en E8.5 E9.5 frente se restrinja progresivamente de contribuir al cerebro medio dorsal, mientras que el linaje Wnt1 persiste en la contribución a cerebro medio ventral.

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	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

Todos los autores contribuyeron igualmente a este trabajo y están ordenados alfabéticamente. La contribución de cada individuo es evidente por su participación en el artículo de vídeo.

El sistema GIFM que hemos demostrado se puede utilizar para responder a una amplia gama de preguntas en una variedad de procesos celulares. Por ejemplo, los ratones diseñados con diferentes conductores de Cre puede ser utilizada para combatir cualquier tipo de célula, tejido o linaje genético de interés. Además, dado que el tamoxifeno puede ser administrada en cualquier punto del tiempo embrionario y postnatal, la recombinación puede dirigirse a cualquiera de las fases de desarrollo correspondientes. El control es...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

Los mapas son generados por el destino marcado y seguimiento de las células in vivo para determinar cómo los progenitores contribuyen a estructuras específicas y los tipos de células en el desarrollo y los tejidos adultos. Un avance en este concepto es que G enetic nducible F comió M apping (GIFM), que une la expresión génica, el destino celular, y el comportamiento de células in vivo, para crear mapas de destino basada en el linaje genético. GIFM explota X-Creer líneas donde X es un gen o un conjunto de elementos reguladores de genes que confieren expresión espacial de una proteína bacteriófagos modificados, la recombinasa Cre (Creer T). Creer T contiene una modificación e estrogénico r dominio ligando eceptor vinculante que hace Creer T secuestrado en el citoplasma en ausencia de la droga tamoxifeno. La unión de tamoxifeno versiones Creer T, que se transloca al núcleo y la recombinación media entre las secuencias de ADN flanqueado por sitios loxP. En GIFM, la recombinación se produce normalmente entre un casete loxP flanqueado parada antes de un gen reportero, como las buenas prácticas agrarias. Los ratones son criados para contener una región o tipo de células específicas Creer y un alelo reportero condicional. Los ratones no tratados no se han marcado por la cinta parada en el Boletín previene la transcripción más del gen reportero. Nosotros administramos el tamoxifeno por sonda oral a tiempo, las mujeres embarazadas, que proporciona un control temporal de la liberación Creer T y posterior translocación al núcleo de quitar el cassette parada de la periodista. Después de la recombinación, el alelo periodista es constitutivamente y expresó heritably. Esta serie de eventos marca las células de tal manera que su historia genética está indeleblemente grabada. El periodista recombinados por lo tanto sirve como un marcador de linaje genético de alta fidelidad que, una vez encendido, es desacoplada de la expresión de los genes utilizados inicialmente para conducir T CREER. Aplicamos GIFM en ratón para estudiar el desarrollo normal y la contribución de determinar el linaje genético de los tipos de células y tejidos adultos. También utilizamos GIFM para seguir las células mutantes en las bases genéticas para comprender mejor los fenotipos complejos que imitan características principales de trastornos genéticos humanos. En este artículo de vídeo guías investigadores a través de métodos experimentales para aplicar con éxito GIFM. Demostramos el método que utiliza nuestro bien caracterizados Wnt1-Creer T, los ratones mediante la administración de tamoxifeno mGFP en el día embrionario (E) 8.5 a través de una sonda nasogástrica seguida de disección en E12.5 y análisis por microscopía estereoscópica epifluorescencia. También se muestra cómo micro-disección de dominios destino asignado para la preparación del explante o análisis FACS y diseccionar adultos mapeado destino, los cerebros de toda imagen de montaje fluorescente. En conjunto, estos procedimientos permiten a los investigadores a abordar las cuestiones críticas en la biología del desarrollo y modelos de enfermedades.

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genéticos inducible destino de asignación (GIFM) las marcas y las células de las pistas con un control preciso espacial y temporal<em&gt; In vivo</em&gt; Y define la forma en las células de un linaje genético específico contribuir al desarrollo y los tejidos adultos. Demostrado aquí son las técnicas necesarias para el destino de embriones de ratón E12.5 mapa para el análisis de epifluorescencia y explante.

Un enfoque práctico de elaboración de mapas genéticos inducible destino: una guía visual para marcar y rastrear las células En Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

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Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K vistas.  Brown University. Genéticos inducible destino de asignación (GIFM) las marcas y las células de las pistas con un control preciso espacial y temporal In vivo Y define la forma en las células de un linaje genético específico contribuir al desarrollo y los tejidos adultos. Demostrado aquí son las técnicas necesarias para el destino de embriones de ratón E12.5 mapa para el análisis de epifluorescencia y explante.

Video: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Un Sistema de Anclaje magnética para investigar control mediado de vuelo visual y olfativa en Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Una guía práctica para Phylogenetics para no expertos

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...