Hasta la fecha, no existe una plataforma de imágenes de células T con receptor de antígeno quimérico clínicamente validada. El simportador de yoduro de sodio representa un informador sensible y clínicamente relevante para obtener imágenes de células T de car mediante PET. Las imágenes T de T de T NIS CAR permiten a los investigadores rastrear de forma no invasiva las células infundidas in vivo y tienen el potencial de predecir la eficacia y la toxicidad de la terapia de células T con CAR.
La obtención de imágenes eficientes de las células T CAR permite la evaluación del tráfico y la expansión de las células T y permite el desarrollo de estrategias para superar las limitaciones. Los métodos descritos en este protocolo son simples y se pueden aplicar a otras construcciones CAR más allá de las mostradas en este estudio. Comience con el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica o PBMC de la muestra de sangre utilizando la técnica de gradiente de densidad estándar.
Para hacerlo, agregue suavemente 15 mililitros de medio de gradiente de densidad a un tubo de separación de gradiente de densidad de 50 mililitros evitando la formación de burbujas. Para evitar la captura celular, diluya la muestra de sangre con PBS que contiene 2% FBS en una relación de volumen de uno a uno y transfiera suavemente la sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad sin romper la interfaz entre los dos. Luego centrifugue el tubo de separación a 1, 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Recoja el sobrenadante en un tubo cónico fresco de 50 mililitros, lave las células con PBS que contenga 2% de FBS llenando el tubo hasta una marca de 50 mililitros y centrifugando el tubo a 300 veces G durante ocho minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante antes de resuspender las células peletizadas en 50 mililitros de PBS que contengan 2% de FBS. Resuspend los PBMC peletizados en PBS que contienen 2% FBS a una concentración de 50 veces 10 a la sexta célula por mililitro.
Repita el lavado en un tubo fresco de 50 mililitros. Cuente el número de células y luego centrífique la suspensión celular a 300 veces G durante ocho minutos a temperatura ambiente. Para el aislamiento de células T, transfiera PBMC aislados a un tubo inferior redondo de poliestireno de 14 mililitros.
Luego, use un kit de cuentas magnéticas de selección negativa para realizar el aislamiento de células T colocando los PBMC en un cóctel de anticuerpos de selección negativa en un separador celular totalmente automatizado. Después del aislamiento de células T, cuente las células y cultive las células en medio de expansión de células T o MTC a una concentración de dos veces 10 a las sextas células por mililitro. A continuación, mezcle el vial que contiene las perlas anti-CD3 / CD28 girando y pipetee el volumen requerido de perlas en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros.
Para el lavado, vuelva a suspender las perlas en un mililitro de MTC antes de colocar el tubo en un imán durante un minuto y aspire el sobrenadante. Después de retirar el tubo del imán, vuelva a suspender las perlas lavadas en un mililitro de MTC y repita el lavado dos veces. Resuspender las perlas lavadas en un mililitro de MTC para transferirlas al cultivo de células T, luego diluir la suspensión de perlas de células T con MTC a una concentración de 1.0 veces 10 a las sextas células por mililitro antes de transferirla a una placa de seis pocillos tratada con cultivo de tejidos.
Incubar la placa del pozo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para progresar con la transducción de lentivirus, descongele los lentivirus congelados en el recubrimiento de los receptores de antígeno quimérico o el simportador de yoduro de sodio a cuatro grados centígrados. Después de 24 a 48 horas de estimulación de células T, mezcle las células T para romper los grupos y agregue el lentivirus recién descongelado a las células en una multiplicidad de infección de cinco.
Incubar las células T transducidas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En los días tres, cuatro y cinco de incubación, cuente las células T transducidas y ajuste la concentración celular a 1.0 veces 10 a la sexta célula por mililitro agregando MTC fresca precalentada. Para las células T transducidas por NIS que portan el gen de resistencia a la puromicina, trate las células con un microgramo por mililitro de diclorhidrato de puromicina en los días tres, cuatro y cinco.
En el sexto día, rompa los grupos de células T y elimine las perlas anti-CD3 / CD28 de las células T transducidas colocando la placa en un imán durante un minuto. Luego coloque las células recolectadas nuevamente en el cultivo a una concentración de 1.0 veces 10 a las sextas células por mililitro. Lavar una alícuota del cultivo de células T que contiene 50.000 células con tampón de flujo y resuspendir las células con 50 microlitros de tampón de flujo.
Para detectar la expresión de CAR, tiñe las células T con un microlitro de anticuerpos anti-ratón de cabra. Para excluir las células muertas, agregue 0.3 microlitros de ALIVE/DEAD Aqua. Incubar las células teñidas en la oscuridad a temperatura ambiente.
Después de 15 minutos, lave las células con 150 microlitros de tampón de flujo a 650 veces G durante tres minutos a cuatro grados Centígrados. Para fijar y permeabilizar las células teñidas, incubar las células con 100 microlitros de medio de fijación durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Luego lave las células dos veces con 100 microlitros de un tampón que contenga un agente permeabilizante celular como la saponina y la centrífuga.
Después del lavado, resuspenda las células permeabilizadas en 50 microlitros de un tampón permeabilizante. Luego agregue 0.3 nanogramos de anticuerpo ETNL NIS antihumano e incube a cuatro grados centígrados. Después de una hora de incubación, lave las células agregando 150 microlitros de tampón de flujo y centrífuga como se ha demostrado.
Luego incubar las células con 50 microlitros de tampón de flujo que contienen 2,5 microlitros de anticuerpo secundario anti-conejo durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de lavar las células T como se ha demostrado, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de flujo para realizar la citometría de flujo. Luego determine la eficiencia de transducción de las células.
En el octavo día, cuente y gire hacia abajo las células T a 300 veces G durante ocho minutos a cuatro grados Celsius antes de volver a depositar el pellet celular con un medio de congelación a una concentración de 10 veces 10 a las sextas células por mililitro. Transfiera un mililitro de la suspensión celular a cada vial criogénico etiquetado para almacenar a menos 80 grados Celsius durante 48 horas. Después de 48 horas, transfiera las células T a nitrógeno líquido.
Prepare a los ratones inyectados con células T BCMA CAR NIS positivas para las imágenes PET / CT pesando los ratones y eliminando las marcas metálicas en los oídos. Luego inyecte 9.25 megabecquerel de tetrafluoroborato F18 recién preparado en el ratón por vía intravenosa a través de la inyección de la vena de la cola. Después de 45 minutos de período de absorción, proceda a adquirir imágenes PET estáticas de un ratón anestesiado durante 15 minutos, seguidas de la adquisición de imágenes por TC durante cinco minutos con rotación de 360 grados y 180 proyecciones.
En este análisis representativo, la cotransducción de dos virus en células T generó células T BCMA CAR NIS positivas, donde más del 90% de las células eran NIS positivas. El análisis de la cinética de crecimiento de células T de cero a ocho días reveló que la incorporación de BCMA CAR y NIS no tuvo un impacto significativo en la expansión de las células T en comparación con las células no transducidas. En el análisis citométrico de flujo de OPM-2, las células transducidas con lentivirus representaron la expresión de GFP tras el tratamiento con puromicina.
Los ratones que recibieron células OPM-2 positivas para luciferasa BCMA positiva fueron sometidos a imágenes de bioluminiscencia para confirmar el injerto de células OPM-2. Las imágenes PET del ratón administrado con tetrafluoroborato F18 revelaron una distribución de células T BCMA CAR NIS positiva en los diversos órganos y médula ósea. Además, las células de la médula ósea recolectadas del ratón mostraron el injerto de células OPM-2 y la entrega de las células T BCMA CAR NIS positivas a la médula ósea.
Para obtener imágenes de alta calidad de células T CAR infundidas, es importante seguir los pasos del protocolo de generación de células T NIS CAR y confirmar la presencia de fracciones duales NIS y CAR positivas.
