Este protocolo puede ayudar a comprender los mecanismos involucrados en la regulación de KCC2 al evaluar directamente su fosforilación del tamaño molecular de la quinasa, arrojando así luz sobre sus funciones y actividades fisiológicas. Se puede utilizar para identificar y caracterizar moléculas como proteínas de interés a partir de mezclas complejas de moléculas relacionadas, incluso cuando una expresión de proteína es muy diminuta. La técnica es una herramienta esencial para el análisis de proteínas de sistemas complejos y la identificación de posibles mecanismos subyacentes a la función o enfermedad aberrante del tejido.
Demostrando los procedimientos estará Sunday Solomon Josiah, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Comience por prearmar todos los reactivos en el baño de cuentas de 37 grados centígrados y descongelar las células embrionarias humanas 293 de rata KCC2b transectadas de manera estable completamente en el baño de cuentas. Luego transfiera las células del tubo del vial criogénico a un tubo de centrífuga que contenga cinco mililitros de medios frescos y centrifugue las células a 1, 200 G durante tres a cinco minutos.
Después de aspirar el sobrenadante con una pipeta aspiradora fijada a una bomba de vacío, resuspenda las células en 10 mililitros de medios frescos. Transfiera la suspensión a una placa de plato de 10 centímetros y deje que crezca durante 48 horas en una incubadora con una temperatura de 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono. Una vez que las células alcancen el 90% de confluencia, divídalas aspirando los medios viejos y enjuagándolos con dos mililitros de PBS.
Agregue dos mililitros de tripsina e incube durante aproximadamente uno o dos minutos a temperatura ambiente. Lave las células tripsinizadas con dos mililitros del medio completo. Agregue nueve mililitros de medios frescos a los nuevos platos.
Luego agregue un mililitro de solución del plato viejo al plato nuevo. Transfiera los platos de células divididas a la incubadora durante 48 horas para lograr más del 90% de confluencia. Trate las células con dimetilsulfóxido, estaurosporina de ocho micromolares o N-etilmaleimida de 0,5 milimolares durante 15 minutos antes de cosechar en tampón de lisis.
Aspire los medios de la placa de cultivo transectada, coloque las placas de cultivo en hielo y lave las células con PBS helado. Aspire el PBS y agregue 1.0 mililitros de tampón de lisis helada al plato. Después de raspar las células del fondo del plato con un raspador de células de plástico frío, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga colocado en hielo, seguido de agitación constante durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de centrifugar los lisados celulares en una centrífuga fría, colóquela en hielo. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco preenfriado y deseche el pellet. Pipetear 300 microlitros de proteína G Sepharose en un tubo de microcentrífuga.
Luego centrifugar la solución a 500 G durante dos minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 500 microlitros de PBS y vórtice bien. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y repita el paso.
A continuación, mezcle un miligramo de anticuerpos anti-KCC2 treonina 906 y anti-KCC2 treonina 1007 con 200 microlitros de perlas de proteína G Sepharose antes de compensar el volumen a 500 microlitros con PBS. Después de agitar en una plataforma vibratoria o rueda giratoria durante dos horas a cuatro grados centígrados, repita dos lavados con PBS. Llevar a cabo la cuantificación de proteínas en los lisados celulares y agregar un miligramo del lisado celular a las perlas lavadas e incubar en un rotador de extremo a extremo antes de girar.
Dé tres lavados con PBS que contenga 150 milimolares de cloruro de sodio, seguidos de tres lavados con 200 microlitros de PBS antes de resuspender el pellet final en 100 microlitros de tampón de muestra LDS. Agite los tubos en un agitador de rotor a temperatura ambiente durante cinco minutos. Incubarlos en un bloque de calentamiento y centrifugarlos antes de usar el sobrenadante para la carga de gel.
Ensamble el aparato de fundición Western Blot y vierta gel separador al 8% recién preparado para fundir el gel, dejando unos dos centímetros de espacio desde la parte superior del vidrio de fundición. Agregue 200 microlitros de isopropanol absoluto a la configuración y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos. Retire el isopropanol con una pipeta y enjuague cuidadosamente el gel con aproximadamente 200 microlitros de agua destilada.
Después de agregar gel de apilamiento al 6% recién preparado a la configuración de fundición, encaje suavemente en el peine del pozo y deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego fije el gel fundido en el tanque de electroforesis. Después de verter el tampón de funcionamiento en el tanque, cargue cinco microlitros de marcador de peso molecular en el primer pocillo y una cantidad igual de proteína en cada pocillo del gel SDS-PAGE.
Llene los pozos vacíos con LDS y haga correr el gel durante unos 90 a 120 minutos a 120 voltios. Rehidratar la membrana de nitrocelulosa con tampón de transferencia que contenga 20% de metanol. Enjuague el gel y la membrana con el tampón de transferencia y extiéndalos suavemente sobre la pila de preparación.
Organice el sándwich a transferir en este orden: electrodo negativo, espuma sándwich, papel de filtro enjuagado gel SDS-PAGE, membrana de nitrocelulosa enjuagada, papel de filtro, espuma sándwich, electrodo positivo. Una vez hecho esto, apile el sándwich ensamblado en el tanque de transferencia y funcione a 90 voltios durante 90 minutos o 30 voltios durante 360 minutos. Bloquee la membrana seca durante una hora a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo.
Incubar las membranas con diluciones apropiadas de anticuerpos primarios y beta-actina en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego dé tres lavados de TBST durante cinco minutos cada uno. Incubar la membrana lavada con un anticuerpo secundario diluido en un tampón de bloqueo durante 60 minutos y repetir tres lavados de TBST.
Una vez hecho esto, coloque la membrana lavada en el tablero de imágenes. Para desarrollar las señales, extienda la solución preparada mezclando volúmenes iguales de cada reactivo de quimioluminiscencia mejorada en la membrana antes de transferir la placa de imágenes al sistema de imágenes para obtener imágenes. El tratamiento de las células HEK293 con estaurosporina y N-etilmaleimida o NEM causó una disminución de la fosforilación en los sitios objetivo SPAK, treonina 233 situada en el dominio de la quinasa del asa T, y el sitio de fosforilación del bucle S serina 373 de la SPAK expresada endógenamente.
La estaurosporina redujo la fosforilación de la serina 940 en células HEK294 que expresan KCC2b de manera estable, pero NEM aumentó significativamente su fosforilación. Además, la estaurosporina disminuye la fosforilación en el sitio de treonina 505, mientras que NEM causó un aumento leve pero insignificante en la fosforilación en el mismo sitio. Los efectos diferenciales de ambos compuestos sobre la fosforilación de la proteína quinasa C en el sitio treonina 505 y KCC2b en el sitio de serina 940 se correlacionan bien.
El resultado representativo también mostró que NEM causó un aumento significativo en la expresión de la cantidad total de KCC2, mientras que la expresión del NKCC1 total y SPAK no cambió significativamente cuando se trató con ambos compuestos. Además, los dos compuestos causaron una disminución de la fosforilación de SPAK en los sitios treonina 233 y serina 373, y esto se correlacionó con la fosforilación abreviada de treonina 906/1007 y treonina 203/207/212 y NKCC1 endógenamente expresada respectivamente. Además, la estaurosporina y NEM redujeron y aumentaron la fosforilación de la proteína quinasa C en el sitio de serina 940 y expresaron de manera estable KCC2b respectivamente, lo que se correlacionó con la reducción y el incremento en la fosforilación de la proteína quinasa C delta en el sitio de treonina 505 tras el tratamiento con estaurosporina y NEM, respectivamente.
Si se usa un anticuerpo primario o secundario inadecuado, la banda no se verá durante la toma de imágenes. Además, la señal puede no ser visible si se utiliza una concentración demasiado baja de anticuerpos. La técnica es una herramienta relevante en el análisis cuantitativo de proteínas y ha permitido su uso para muchos propósitos científicos y de recursos, incluso como una herramienta efectiva de diagnóstico temprano.
