Este es un método novedoso para la evaluación de la hormona glucocorticoides, cortisol, de piel de koala. Proporciona un nuevo biomarcador para la evaluación del estrés crónico en koalas. La principal ventaja de esta técnica es que es un método altamente sensible y reproducible con un tiempo de respuesta bastante rápido entre la preparación de la muestra y el ensayo hormonal.
Esta técnica permite la evaluación cuantitativa del estrés crónico en koalas, que es una herramienta de gestión clínica muy útil. Me ayuda con este procedimiento Dylan Fox, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento recuperar el pelaje del almacenamiento a menos 80 grados Celsius y dejar que se descongele a temperatura ambiente.
A continuación, pese el pelaje en una balanza de precisión analítica de laboratorio. Coloque 60 miligramos de pelaje en un tubo centrífuga prepesado y etiquetado de 1,5 mililitros y repita esto hasta que se llenen 18 tubos. Con una pipeta, agregue un mililitro de isopropanol de grado 100%HPLC a cada tubo.
Vórtice las muestras durante 30 segundos. Colar cada muestra con un tamiz de micropreistro de 0,5 mililitros para lograr la separación del líquido y el pelaje, y desechar el líquido en un contenedor de residuos. Coloque cada muestra de piel en un bote de pesaje de plástico etiquetado.
A continuación, coloque los botes de pesaje en un desecador de vacío y deje durante tres días para dejar que el pelaje se seque. Una vez que el pelaje esté completamente seco, coloque cada muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado. Coloque cada muestra en un molino de cuentas con tres perlas de acero cromado y pulverizar durante dos minutos a 30 batidos por segundo.
Repita esta transferencia con metanol de grado 100% analítico e isopropanol de grado analítico del 100% hasta que se hayan llenado 18 tubos totales. Después de esto, utilice una pipeta para transferir un mililitro de la primera técnica de extracción en seis tubos centrífugos de 1,5 mililitros que contienen la muestra de piel. Tapa cada tubo, y usa una coctelera para incubarlos a temperatura ambiente con pulsaciones constantes durante al menos 12 horas.
A continuación, colar las muestras con un tamiz de micropreistro de 0,5 mililitros. Utilice una pipeta para transferir el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado, asegurándose de que el pelaje se deseche adecuadamente. En una campana de humo, pruebe completamente el extracto de disolvente bajo una corriente de vapor de nitrógeno.
A continuación, reconstituya la muestra seca con 400 microlitros de tampón de ensayo y 100 microlitros de etanol 100% de grado analítico. Para realizar los controles, primero seleccione muestras de animales con exposición conocida al estresor. Para hacer una piscina de extractos, tome 20 microlitros de extracto de cada muestra hasta obtener un volumen total de 200 microlitros.
Almacene el grupo de extractos a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para ejecutar ensayos. Cuando esté listo, obtenga el factor de dilución para los puntos de unión del 30% y 70% del gráfico de paralelismo para el extracto contra el estándar de cortisol, y utilice el búfer de ensayo para diluir el grupo de muestras adecuadamente para crear los controles altos y bajos. El uso de un kit comercial de cortisol configura una placa de tira de 96 pozos que incluye las muestras, controles, estándares de cortisol, pozos no específicos y pozos de máxima unión de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Utilice la hoja de diseño de placas incluida en el folleto del kit para enumerar las posiciones de las muestras, controles y normas. A continuación, siga el proceso de extracción de la hormona de la piel descrito anteriormente para obtener 100%metanol-extraído piel de koala. Prepare los reactivos del kit de cortisol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Pipeta 50 microlitros de muestras o estándares en los pozos de la placa. Pipeta 75 microlitros de tampón de ensayo en los pozos no específicos, y 50 microlitros de búfer de ensayo en los pozos de unión máxima. Usando una pipeta repetidor añadir 25 microlitros del conjugado de cortisol a cada pozo.
Luego, pipetea 25 microlitros del anticuerpo cortisol en cada pozo, excepto los pozos no específicos. Toque suavemente los lados de la placa para asegurarse de que los reactivos estén bien mezclados. Cubra la placa con el sellador de placas y utilice un agitador orbital para agitar a temperatura ambiente durante una hora.
Después de esto, retire el sello de la placa y aspire la placa de pozo lavando cada pozo con 300 microlitros de tampón de lavado cuatro veces. A continuación, seque el plato tocándolo sobre toallas absorbentes limpias. Pipeta 100 microlitros de sustrato de tetrametilbenzidina a cada pozo.
Coloque el sellador de placas en la placa del pozo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, pipetear 50 microlitros de solución de parada en cada pozo. Transfiera la placa a un lector de placas capaz de leer 450 nanómetros y calcule la concentración hormonal final como se describe en el protocolo de texto.
En este estudio, la detección de ensayos de metabolitos hormonales de interés se determina utilizando paralelismo. En la curva de paralelismo, el punto de unión del 50% determina el factor de dilución de la muestra en la curva estándar. Como se puede ver, los extractos de 100%etanol y 100%isopropanol no proporcionaron desplazamiento paralelo contra el estándar de cortisol.
Sin embargo, el extracto de 100% metanol proporciona desplazamiento paralelo contra el estándar de cortisol. Los coeficientes de variación intra e interensayo se determinan a partir de extractos de muestra de alta y baja unión que se ejecutan en todos los ensayos. Los controles internos de baja unión se ven como una piscina de extracto de koala ordenada, mientras que los controles internos de alta unión se consideran una a dos piscina de extracto de koala diluida.
La asociación entre cada extracto de disolvente y el estándar de cortisol se determina mediante una gráfica de regresión. El extracto de 100%metanol proporciona la mejor línea de regresión con el valor R cuadrado más alto en comparación con los extractos de 100% etanol y 100% isopropanol. Es importante recordar que el paso de lavado de la muestra debe realizarse antes de moler las muestras para evitar la pérdida de hormonas esteroides.
Después de este procedimiento, podemos medir otras hormonas esteroides, como las hormonas reproductivas para mirar las interacciones entre el estrés y la reproducción en koalas. Esta técnica proporciona una nueva herramienta para el campo emergente de la fisiología de la conservación, permitiendo la evaluación no invasiva del cortisol en el pelaje koala. El kit comercial de cortisol proporciona reactivos en cantidad mínima.
Sin embargo, es importante usar equipo de protección personal para minimizar las lesiones a uno mismo mientras se lleva a cabo este procedimiento de laboratorio.
