Este enfoque permite investigar la identidad celular, la integración y la funcionalidad de las interneuronas trasplantadas durante un tiempo prolongado en el desarrollo de cerebros sanos y enfermos. El protocolo describe una generación rápida y altamente eficiente de precursores GABAérgicos derivados de células madre humanas que sobreviven y maduran en el hipocampo de ratones ingenuos y transgénicos. Este enfoque nos ayuda a evaluar el potencial terapéutico del uso de la terapia celular en trastornos del desarrollo donde las interneuronas están comprometidas.
Para comenzar, retire el medio de cultivo celular de los precursores de interneuronas de origen humano y enjuague cuidadosamente con DPBS sin calcio y magnesio. Agregue 400 microlitros de la solución de desprendimiento celular a cada pocillo de la placa de seis pocillos. Incubar durante dos o tres minutos a 37 grados centígrados en la incubadora hasta que el borde de las células comience a verse brillante.
Luego, agregue 600 microlitros de medio N2 fresco a cada pocillo de la placa de seis pocillos para detener la solución de desprendimiento celular y separe mecánicamente las células con una pipeta para obtener una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión celular a un tubo de plástico y centrifugar a 180 G durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante utilizando un sistema de vacío y vuelva a suspender el pellet en el medio de trasplante.
Cuente el total de células en la suspensión utilizando una cámara de conteo y un contador de recuento, y ajuste el volumen a una concentración final de 100, 000 células por microlitro. Mantenga la suspensión celular en un tubo cerrado sobre hielo hasta el trasplante durante un máximo de cuatro horas. Inmediatamente después de la anestesia, coloque al cachorro sobre un pañuelo húmedo en la superficie del hielo húmedo durante tres minutos hasta que las extremidades superiores se vuelvan blanquecinas.
Vuelva a suspender las células con cuidado con la pipeta y cargue la jeringa con la suspensión celular. Coloque al cachorro colocándolo en el marco estereotáxico y usando las barras para los oídos en la dirección opuesta. A continuación, limpie la superficie de la piel con un pañuelo blando empapado en etanol.
Identifique lambda y establezca las coordenadas en cero en la consola de visualización digital del instrumento estereotáxico. Después de reubicar la jeringa de Hamilton en las coordenadas deseadas, use una aguja de insulina doblada a 90 grados para penetrar en el cráneo, creando un pequeño agujero. Luego, baje la jeringa de Hamilton hasta que la aguja cruce el cráneo y ponga a cero la coordenada dorsoventral.
Baje la aguja hasta que se alcancen las coordenadas dorsoventrales deseadas. Retraiga la aguja lentamente una vez que se hayan inyectado las células madre. Termine el procedimiento calentando al cachorro con las manos hasta que comience a moverse antes de devolvérselo a la madre.
No se encontró reacción inmune o inflamación local contra las células trasplantadas ni en el día postnatal 14 ni dos meses después del trasplante, según lo evaluado por la ausencia de microglia reactiva identificada mediante Iba1, CD68 y galectina-3. La extensión de la astrogliosis está determinada por la proteína ácida fibrilar glial y citoquinas inflamatorias, como la interleucina-1, y la ausencia de linfocitos citotóxicos. En los ratones knock-out Cntnap2, las células similares a las interneuronas derivadas de células madre humanas sobrevivieron hasta nueve meses después del trasplante y se localizaron en el sitio de la inyección.
Aunque, también se dispersaron a través del hipocampo ipsilateral e incluso contralateral, como se observó en los ratones de tipo salvaje. El protocolo requiere práctica para garantizar la mínima interrupción y compresión del cerebro, así como mantener un buen equilibrio entre la velocidad del procedimiento y la precisión de las coordenadas. Este protocolo es compatible con una variedad de técnicas, como estudios de conectividad o lecturas funcionales como electrofisiología o estudios de comportamiento, dependiendo de su investigación, cuestión de interés.
