Essa abordagem permite investigar a identidade celular, a integração e a funcionalidade dos interneurônios transplantados por um longo período de tempo no desenvolvimento de cérebros saudáveis e doentes. O protocolo descreve uma geração rápida e altamente eficiente de interneurônios GABAérgicos derivados de células-tronco humanas como precursores que sobrevivem e amadurecem no hipocampo de camundongos ingênuos e transgênicos. Essa abordagem nos ajuda a avaliar o potencial terapêutico do uso da terapia celular em distúrbios do desenvolvimento em que os interneurônios estão comprometidos.
Para começar, remova o meio de cultura celular dos precursores de interneurônios derivados do homem e enxágue cuidadosamente com DPBS sem cálcio e magnésio. Adicionar 400 microlitros da solução de descolamento celular a cada poço da placa de seis poços. Incube por dois a três minutos a 37 graus Celsius na incubadora até que a borda das células comece a parecer brilhante.
Em seguida, adicione 600 microlitros de meio N2 fresco a cada poço da placa de seis poços para parar a solução de descolamento celular e desprenda mecanicamente as células usando uma pipeta para obter uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão da célula para um tubo de plástico e centrífuga a 180 G durante quatro minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante usando um sistema de vácuo e ressuspenda o pellet no meio de transplante.
Conte o total de células na suspensão usando uma câmara de contagem e um contador de contagem e ajuste o volume para uma concentração final de 100.000 células por microlitro. Mantenha a suspensão celular em um tubo fechado sobre gelo até o transplante por um período máximo de quatro horas. Imediatamente após a anestesia, coloque o filhote em um tecido molhado na superfície do gelo molhado por três minutos até que os membros superiores fiquem esbranquiçados.
Ressuspenda cuidadosamente as células com a pipeta e carregue a seringa com a suspensão celular. Posicione o filhote colocando-o na estrutura estereotáxica e usando as barras auriculares na direção oposta. Em seguida, limpe a superfície da pele usando um tecido mole embebido em etanol.
Identifique lambda e defina as coordenadas como zero no console de exibição digital do instrumento estereotáxico. Depois de realocar a seringa Hamilton para as coordenadas desejadas, use uma agulha de insulina dobrada de 90 graus para penetrar no crânio, criando um pequeno buraco. Em seguida, traga a seringa de Hamilton para baixo até que a agulha cruze o crânio e zere a coordenada dorsoventral.
Abaixe a agulha até que as coordenadas dorsoventrais desejadas sejam alcançadas. Retraia a agulha lentamente uma vez que as células-tronco tenham sido injetadas. Termine o procedimento aquecendo o filhote com as mãos até que ele comece a se mover antes de devolvê-lo à mãe.
Nenhuma reação imune ou inflamação local contra as células transplantadas foi encontrada no dia pós-natal 14 ou dois meses após o transplante, conforme avaliado pela ausência de micróglia reativa identificada usando Iba1, CD68 e galectina-3. A extensão da astrogliose é determinada pela proteína glial fibrilar ácida e citocinas inflamatórias, como a interleucina-1, e pela ausência de linfócitos citotóxicos. Nos camundongos knock-out Cntnap2, as células interneurônicas derivadas de células-tronco humanas sobreviveram até nove meses após o transplante e foram localizadas no local da injeção.
Embora, eles também foram dispersos através do hipocampo ipsilateral e até mesmo contralateral, como observado nos ratos do tipo selvagem. O protocolo requer prática para garantir o mínimo de interrupção e compressão do cérebro, bem como manter um bom equilíbrio entre a velocidade do procedimento e a precisão das coordenadas. Este protocolo é compatível com uma série de técnicas, como estudos de conectividade ou leituras funcionais como eletrofisiologia ou estudos comportamentais, dependendo da sua pesquisa, questão de interesse.
