Cette approche permet d’étudier l’identité cellulaire, l’intégration et la fonctionnalité des interneurones transplantés sur une période prolongée dans le développement de cerveaux sains et malades. Le protocole décrit une génération rapide et très efficace d’interneurones GABAergiques dérivés de cellules souches humaines comme des précurseurs qui survivent et mûrissent dans l’hippocampe de souris naïves et transgéniques. Cette approche nous aide à évaluer le potentiel thérapeutique de l’utilisation de la thérapie cellulaire dans les troubles du développement où les interneurones sont compromis.
Pour commencer, retirez le milieu de culture cellulaire des précurseurs interneuronaux d’origine humaine et rincez soigneusement avec du DPBS sans calcium ni magnésium. Ajouter 400 microlitres de la solution de détachement de cellule à chaque puits de la plaque à six puits. Incuber pendant deux à trois minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur jusqu’à ce que la bordure des cellules commence à briller.
Ensuite, ajoutez 600 microlitres de milieu N2 frais à chaque puits de la plaque à six puits pour arrêter la solution de détachement de cellule et détachez mécaniquement les cellules à l’aide d’une pipette pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans un tube en plastique et centrifuger à 180 G pendant quatre minutes à température ambiante. Jeter le surnageant à l’aide d’un système de vide et remettre en suspension la pastille dans le milieu de transplantation.
Comptez le nombre total de cellules dans la suspension à l’aide d’une chambre de comptage et d’un compteur de comptage, et ajustez le volume à une concentration finale de 100 000 cellules par microlitre. Gardez la suspension cellulaire dans un tube fermé sur de la glace jusqu’à la transplantation pendant un maximum de quatre heures. Immédiatement après l’anesthésie, placez le chiot sur un tissu humide à la surface de la glace humide pendant trois minutes jusqu’à ce que les membres supérieurs deviennent blanchâtres.
Remettez soigneusement les cellules en suspension avec la pipette et chargez la seringue avec la suspension cellulaire. Positionnez le chiot en le plaçant sur le cadre stéréotaxique et en utilisant les barres d’oreille dans la direction opposée. Ensuite, nettoyez la surface de la peau à l’aide d’un tissu mou imbibé d’éthanol.
Identifiez lambda et réglez les coordonnées à zéro sur la console d’affichage numérique de l’instrument stéréotaxique. Après avoir déplacé la seringue Hamilton aux coordonnées souhaitées, utilisez une aiguille à insuline pliée à 90 degrés pour pénétrer dans le crâne, créant ainsi un petit trou. Ensuite, abaissez la seringue Hamilton jusqu’à ce que l’aiguille traverse le crâne et mettez à zéro la coordonnée dorso-ventrale.
Abaissez l’aiguille jusqu’à ce que les coordonnées dorso-vendérales souhaitées soient atteintes. Rétractez lentement l’aiguille une fois que les cellules souches ont été injectées. Terminez la procédure en réchauffant le chiot avec les mains jusqu’à ce qu’il commence à bouger avant de le rendre à la mère.
Aucune réaction immunitaire ou inflammation locale contre les cellules transplantées n’a été observée au 14e jour postnatal ou deux mois après la transplantation, comme l’évalue l’absence de microglie réactive identifiée à l’aide d’Iba1, de CD68 et de galectine-3. L’étendue de l’astrogliose est déterminée par la protéine acide fibrillaire gliale et les cytokines inflammatoires, telles que l’interleukine-1, et l’absence de lymphocytes cytotoxiques. Chez les souris knock-out Cntnap2, les cellules interneurones dérivées de cellules souches humaines ont survécu jusqu’à neuf mois après la transplantation et ont été localisées au site d’injection.
Cependant, ils ont également été dispersés à travers l’hippocampe ipsilatéral et même controlatéral, comme observé chez les souris de type sauvage. Le protocole exige une pratique pour assurer la perturbation et la compression minimales du cerveau, ainsi que le maintien d’un bon équilibre entre la vitesse de la procédure et la précision des coordonnées. Ce protocole est compatible avec une gamme de techniques, telles que les études de connectivité ou les lectures fonctionnelles comme l’électrophysiologie ou les études comportementales, en fonction de votre recherche, question d’intérêt.
