השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות

גישה זו מאפשרת לחקור את הזהות התאית, האינטגרציה והתפקוד של אינטרנורונים מושתלים לאורך זמן ממושך בפיתוח מוחות בריאים וחולים. הפרוטוקול מתאר דור מהיר ויעיל ביותר של תאי גזע אנושיים שמקורם בתאי גזע GABAergic interneuron כמו מבשרים ששורדים ומבשילים להיפוקמפוס של עכברים תמימים ומהונדסים. גישה זו מסייעת לנו להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של שימוש בטיפול תאי בהפרעות התפתחותיות שבהן אינטרנורונים נפגעים.

כדי להתחיל, הסר את מדיום תרבית התאים ממבשרי interneuron שמקורם בבני אדם ושטוף בזהירות עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 400 מיקרוליטרים של תמיסת ניתוק התאים לכל באר של צלחת שש הבארות. דגירה במשך שתיים-שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עד שגבול התאים מתחיל להיראות מבריק.

לאחר מכן, הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מדיום N2 טרי לכל באר של צלחת שש הבארות כדי לעצור את תמיסת ניתוק התאים וניתקו מכנית את התאים באמצעות פיפטה כדי להשיג תרחיף של תא יחיד. העבירו את מתלה התא לצינור פלסטיק וצנטריפוגה ב-180 גרם למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופר-נטנט באמצעות מערכת ואקום ולהשהות את הכדור במדיום ההשתלה.

לספור את סך התאים בהשעיה באמצעות תא ספירה ומונה tally, ולהתאים את עוצמת הקול לריכוז סופי של 100, 000 תאים למיקרוליטר. שמור את תרחיף התא בצינור סגור על הקרח עד להשתלה למשך ארבע שעות לכל היותר. מיד לאחר ההרדמה, הניחו את הגור על רקמה רטובה על פני קרח רטוב למשך שלוש דקות עד שהגפיים העליונות הופכות לבנבנות.

החזירו את התאים בזהירות עם הפיפטה וטענו את המזרק עם השעיית התא. מקמו את הגור על ידי הניחתו על המסגרת הסטריאוטקסית ושימוש במוטות האוזניים בכיוון ההפוך. לאחר מכן, נקה את פני העור באמצעות רקמה רכה ספוגה באתנול.

זהה למבדה והגדר את הקואורדינטות לאפס בקונסולת התצוגה הדיגיטלית של המכשיר הסטריאוטקסי. לאחר העברת מזרק המילטון לקואורדינטות הרצויות, השתמש במחט אינסולין מכופפת של 90 מעלות כדי לחדור לגולגולת, וליצור חור זעיר. לאחר מכן, הורידו את מזרק המילטון עד שהמחט חוצה את הגולגולת ואפס את הקואורדינטות הדורסו-בנטרליות.

הורידו את המחט עד להשגת הקואורדינטות הדורסו-וונטריות הרצויות. החזירו את המחט באיטיות לאחר הזרקת תאי הגזע. סיים את ההליך על ידי חימום הגור עם הידיים עד שהוא מתחיל לזוז לפני שהוא נותן אותו בחזרה לאם.

לא נמצאה תגובה חיסונית או דלקת מקומית נגד התאים המושתלים ביום 14 שלאחר הלידה או חודשיים לאחר ההשתלה, כפי שהוערך על ידי היעדר מיקרוגליה תגובתית שזוהתה באמצעות Iba1, CD68 ו- galectin-3. מידת האסטרוגליוזיס נקבעת על ידי חלבון חומצי פיברילרי גליאלי וציטוקינים דלקתיים, כגון אינטרלוקין-1, והיעדר לימפוציטים ציטוטוקסיים. בעכברי הנוק-אאוט Cntnap2, התאים דמויי תאי הגזע האנושיים שמקורם בתאי גזע שרדו עד תשעה חודשים לאחר ההשתלה והיו ממוקמים באתר ההזרקה.

אמנם, הם היו מפוזרים גם על פני ההיפוקמפוס האיפסילטרלי ואפילו ההיפוקמפוס הקונטרלטרלי, כפי שנצפה בעכברים מסוג בר. הפרוטוקול דורש תרגול כדי להבטיח את ההפרעה והדחיסה המינימלית של המוח, כמו גם שמירה על איזון טוב בין מהירות ההליך לבין הדיוק של הקואורדינטות. פרוטוקול זה תואם למגוון טכניקות, כגון מחקרי קישוריות או קריאות פונקציונליות כמו אלקטרופיזיולוגיה או מחקרים התנהגותיים, בהתאם למחקר שלך, שאלת עניין.