Un método de laboratorio objetivo presentado aquí puede ayudar a estudiar la reacción de hipersensibilidad de contacto en ratones, que imita la dermatitis alérgica de contacto en humanos. La reacción de hipersensibilidad de contacto se puede medir no solo por edema de oído, sino también por diversas pruebas de laboratorio que permiten el estudio de los mecanismos celulares involucrados en esta reacción. El modelo de hipersensibilidad más en contacto puede probar varios factores ambientales y nuevas sustancias para mostrar si los factores probados modulan las respuestas inmunes dependientes de células T, que pueden usarse para implementar nuevas terapias.
Comience afeitando la piel del ratón con una hoja de afeitar y etiquetando la pata. Seis horas antes de la inducción de la hipersensibilidad de contacto, o CHS, aplique jabón gris con agua y afeite un área de dos centímetros cuadrados en el pecho y el abdomen del ratón. El mismo día, sensibilizar a los ratones aplicando 150 microlitros de 5% recién preparado en el lugar previamente afeitado.
En el ratón de control, aplique únicamente el vehículo. Seque el punto de hapteno durante 30 segundos antes de volver a colocar al animal en la jaula. En el cuarto día, medir el grosor de la oreja de un ratón anestesiado usando un micrómetro a la hora cero por un observador que desconoce los grupos experimentales.
Luego, aplique 10 microlitros de 04% hapteno recién preparado en ambos lados de las orejas en grupos de prueba y control y deje que se seque durante 30 segundos. En el día cinco, 24 horas después de la aplicación anterior de 0,4% de hapteno, repita la medición del grosor de la oreja para la medición de 24 horas. 24 horas después de la medición del grosor de la oreja, cuando el ratón todavía esté en anestesia profunda, corte las orejas lo más cerca posible del cráneo con tijeras.
En el lado distal de las orejas, haga un punzón de seis milímetros de diámetro con un punzón de biopsia. Mida el peso de cada biopsia de oído en la balanza analítica y explíquelo en miligramos. Para el ensayo de mieloperoxidasa, o MPO, coloque las biopsias de oído en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros con perlas de acero inoxidable y agregue 500 microlitros del tampón preparado.
Homogeneizar las biopsias durante 10 minutos en un homogeneizador y luego enfriar la muestra durante 15 minutos a 4 grados centígrados antes de homogeneizarla nuevamente durante 10 minutos. Saque las perlas una vez que las biopsias estén homogeneizadas. Congele los homogeneizados a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos.
Descongele y vortex las muestras, y repita el procedimiento de homogeneización y congelación tres veces. Una vez hecho esto, centrifugar el homogeneizado a 3, 000 G durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Coseche el sobrenadante con una pipeta para medir la actividad MPO y explíquelo en unidades por miligramo de proteína.
Para realizar una prueba de permeabilidad vascular, sensibilizar a los ratones en el día cero y en el día cuatro, desafie directamente aplicando hapteno en las orejas utilizando el procedimiento mencionado anteriormente. 23 horas más tarde, inyecte por vía intravenosa 8,3 microlitros por gramo de peso corporal de colorante azul Evans al 1% en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, o DPBS, al ratón anestesiado. Después de una hora, vuelva a anestesiar al ratón para recoger las biopsias de oído, como se describió anteriormente.
Para extraer el tinte del tejido, incubar las biopsias en los tubos que contienen un mililitro de formamida a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. Después de recolectar biopsias de oído, cuando el ratón todavía esté bajo anestesia profunda, retire el globo ocular con pinzas. Aplique una presión suave sobre el ratón y recoja sangre del seno retroorbitario en el tubo para la recolección de suero.
Invierta el tubo seis veces y espere 30 minutos para que la sangre se coagule. Luego, centrifugar el tubo a 1, 300 a 2, 000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sensibilizar a los ratones donantes con TNCB hapteno en el día cero utilizando el procedimiento mencionado anteriormente En el cuarto día, después de desinfectar la piel, aislar los ganglios linfáticos axilares e inguinales, o ALN, del ratón anestesiado con fórceps, seguido de aislar el bazo.
Triture el tejido entre los extremos esmerilados de dos portaobjetos de microscopio y pase la suspensión celular a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 micrómetros. Luego, lave las células con DPBS suplementado con suero bovino fetal al 1% y centrifugarlas a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet celular restante en uno a cinco mililitros de DPBS.
Prepare una mezcla 1: 1 de ALN y bazo para lograr una concentración de hasta 7.0 veces 10 a la séptima célula en 200 microlitros de DBPS antes de inyectar por vía intravenosa la mezcla de células efectoras de CHS en un ratón anestesiado. Mide el grosor de la oreja a la hora cero y después de 24 horas del desafío. Los datos mostraron que los ratones sensibilizados a TNCB y desafiados en los oídos cuatro días después desarrollaron un aumento significativo de la hinchazón del oído, en comparación con los ratones de control sensibilizados simuladamente y luego desafiados de manera similar.
El aumento del edema del oído en el grupo de prueba resultó en un aumento del peso del oído, la actividad de MPO, la concentración de interferón gamma en los extractos del oído, cambios edematosos en la dermis en el examen histológico y permeabilidad vascular del oído Los anticuerpos IgG1 específicos de TNP se elevaron en los sueros de los ratones de prueba en comparación con los animales de control. Los animales que recibieron las células efectoras de CHS de donantes previamente sensibilizados con TNCB mostraron un aumento significativo de la hinchazón del oído, en comparación con los animales que no recibieron las células. El momento más crítico es desencadenar la hipersensibilidad de contacto.
La solución de Hapten es muy volátil y sensible a la luz, por lo que debe aplicarse rápidamente a la piel de los animales. Se pueden realizar pruebas adicionales en las células efectoras aisladas. Por ejemplo, se pueden establecer cultivos celulares para evaluar la capacidad de proliferar en presencia de antígenos.
