Este protocolo proporciona un marco para estudiar la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente staphylococcus aureus. El protocolo utiliza análisis lipidómicos imparciales y partículas de lipoproteínas aisladas de las yemas de huevo de pollo como fuente económica de ácidos grasos complejos para cuantificar la incorporación de ácidos grasos en lípidos bacterianos. Las técnicas de espectrometría de masas que se describen aquí ofrecen una perspectiva sin igual del perfil de ácidos grasos de los lípidos estafilococos aureus, pero se pueden adaptar para estudiar otras membranas bacterianas.
Al realizar este protocolo, se debe tener cuidado de que cada paso de fraccionamiento identifique y conserve la fracción que contiene LDL. La eliminación del sulfato de amoníaco de la fracción de plasma es fundamental para las aplicaciones posteriores de los LDL. Proporcionar un amplio espacio en el tubo y cambiar el agua según sea necesario para permitir la diálisis eficaz.
Para comenzar, lave dos yemas de huevo dos veces con 30 mililitros de solución salina tamponada de fosfato estéril para eliminar la albúmina residual. Perfore la membrana vitellina con una punta de pipeta estéril y drene el contenido de la membrana en un tubo de centrífuga cónica estéril de 50 mililitros. Añadir aproximadamente de 24 a 30 mililitros o 17 molares de solución de cloruro sódico a pH siete a la yema del huevo y mezclar vigorosamente.
A continuación, coloque el tubo en una coctelera para mezclar a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Centrifugar la dilución de la yema de huevo a 10 grados centígrados a 10.000 g durante 45 minutos. Transfiera la fracción de plasma sobrenadante en un tubo cónico estéril de 50 mililitros, dejando atrás la fracción granular peletónica.
Y centrifugar otra vez. En primer lugar, mezcle la fracción de plasma con un 40 por ciento de sulfato de amonio por volumen de masa en un agitador o dispositivo similar a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Después de ajustar el pH, centrifugar la fracción de plasma a cuatro grados Celsius y 10.000 g durante una duración de 45 minutos.
Retire la fracción amarilla semisólida superior en tubos de diálisis de tamaño de poro de siete kilodalton. Proporcione un mínimo del 25% de espacio adicional en el tubo para permitir que se hinche. Coloque el tubo de diálisis en tres litros de agua ultrapura para dializar durante la noche a tres grados centígrados para eliminar el sulfato de amonio.
Después de la diálisis, centrifugar la solución a cuatro grados centígrados como se describió anteriormente. Retire con cuidado la fracción amarilla semisólida superior a un tubo estéril y guárdelo a cuatro grados centígrados. Después de la incubación nocturna del cultivo, transfiera 500 microlitros a dos matraces estériles de 250 mililitros conflectores que contengan 49,5 mililitros de caldo de triptona al 1%.
Incubar durante aproximadamente cuatro horas a 37 grados centígrados con temblores para alcanzar la fase media larga. Transfiera 100 mililitros de cultivo en incrementos de 25 mililitros a cuatro tubos estériles de centrífuga de 50 mililitros y centrifuga los cuatro tubos a 10.000 veces g para peletizar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet celular en 750 microlitros de caldo de triptona al 1%.
Combine las cuatro suspensiones de células de microlitro 750 en un solo tubo de 15 mililitros. Y alícuota 350 microlitros de la suspensión celular en seis tubos estériles de centrífuga de 1,5 mililitros. Utilice una pipeta para añadir 30 microlitros de LDL en el tubo centrífugo de 1,5 mililitros para lograr una concentración final deseada del 5% e incubar a 37 grados centígrados con temblores durante cuatro horas.
Centrifugar las culturas a cuatro grados centígrados a 16.000 veces g durante una duración de dos minutos. Y re-suspenda los gránulos celulares en 330 microlitros de solución salina estéril tamponada al fosfato para lavar. Repita este lavado una vez más.
Registre el peso de los seis gránulos de células húmedas restando el peso del tubo vacío. Congela los gránulos de la célula sobre hielo seco. Primero agregue una cucharada de cuentas de óxido de circonio de 5 milímetros en la parte superior de cada pellet celular.
Agregue 740 microlitros de metanol de grado 75%HPLC refrigerados a menos 80 grados Celsius directamente en cada tubo. A continuación, añadir dos microlitros de 50 micromolar dimyristoyl fosfatidilcolina como un estándar interno. Coloque la muestra que contiene tubos centrífugos de 1,5 mililitros en un puerto disponible en un homogeneizador de tejido mezclador de balas.
Homogeneizar las muestras a baja velocidad. Fijando de dos a tres durante tres minutos. Inspeccione visualmente las muestras en busca de homogeneidad.
Si los grupos de células son visibles, continúe la homogeneización en la licuadora de balas en incrementos de dos minutos. A continuación, añada 270 microlitros de cloroformo a cada muestra en una campana de humo química. Vórtice las muestras vigorosamente durante 30 minutos.
Centrifugar las muestras en una centrífuga de sobremesa hasta 30 minutos como mínimo de 2.000 g. En la campana de humo químico, recoger el sobrenadante monofásico y transferirlo a un nuevo tubo de ensayo evitando cuidadosamente el pellet de proteína en la parte inferior del tubo de extracción. Transfiera los extractos de lípidos diluidos previamente preparados a un vial de automuestreador adecuado.
Para el análisis basado en inyección de flujo, coloque los viales de muestreador automático en un muestreador automático controlado por temperatura de un sistema HPLC que sea capaz de aplicaciones de flujo capilar. Configure el sistema HPLC de acuerdo con el manuscrito. El eluyente se introduce desde la línea de transferencia HPLC al espectrómetro de masas a través de una fuente de ionización de electrospray equipada con una aguja metálica de bajo flujo de calibre 34.
En el software de control de instrumentos Thermo Tune Plus, ajuste la tensión de ionización a 4.000 voltios y el gas de vaina en cinco. Del mismo modo, ajuste la temperatura capilar a 150 grados Celsius y la lente S en 50%Haga clic en el botón definir escaneo, y en el menú del analizador, seleccione FTMS. Establezca el campo de rango de masa en normal y, en el campo de resolución, seleccione 100.000.
Asegúrese de que el tipo de análisis esté establecido en full. En el menú Rangos de escaneo, escriba 200 en el primer campo de masa e introduzca 2.000 en el último campo de masa. Después de definir aún más la precisión de masa observada, promedia la señal a través del pico amplio en el cromatograma iónico total.
Haga clic con el botón derecho en el icono de la huella digital en la ventana de visualización del espectro de masas y seleccione ver la lista de espectro. En el mismo menú, seleccione las opciones de visualización y, a continuación, el cuadro de alternancia de todos los picos en el menú de visualización. Haga clic en el botón Aceptar para cerrar la ventana de visualización.
Haga clic con el botón derecho en el icono de la huella digital en la ventana de visualización del espectro de masas de nuevo y seleccione la masa exacta del portapapeles de exportación. Pegue la celda de datos exportada A1 de la primera hoja de trabajo en la nueva hoja de cálculo de Excel y continúe de acuerdo con el manuscrito. Para realizar identificaciones precisas de lípidos basados en masa, abra el software LIMSA.
En el menú principal, seleccione la lista de picos en el menú de tipo de espectro. Seleccione el modo positivo o el modo negativo para que se corresponda con la polaridad en la que se adquirieron los datos de espectrometría de masas. En el ancho completo del pico a la mitad máximo y sobre la ventana z, introduzca la ventana de búsqueda en masa deseada para la búsqueda de picos.
En este protocolo, el contenido de LDL de la fracción plasmática se enriqueció aún más con la precipitación de los levitinas beta de 30 a 40 kilodalton. La presencia de bandas proteicas a 140, 80, 65, 60 y 15 kilodalton se correlacionan con las apoproteínas de las LDL.
Mientras que suplementar cultivos con plasma de yema de huevo como fuentes de ácidos grasos exógenos supera la inhibición del crecimiento inducido por triclosán. Del mismo modo, la suplementación de cultivos tratados con triclosán con LDL de yema de huevo enriquecida restaura el crecimiento. Además, la adición de LDL de yema de huevo apoya el crecimiento de un ácido graso S.aureus previamente caracterizado, auxotroph.
El contenido de ácidos pregrasados se midió en un 1%caldo de triptona o LDL de yema de huevo de pollo mediante el empleo de espectrometría de masas precisa de alta resolución de inyección de flujo. Se encontraron cantidades mínimas de ácido graso libre. Ortogonal parcial mínimos cuadrados análisis discriminantes de abundante estafiloco aureus membrana fosfolípidos demostrado clara separación de clase, con una composición de ácidos grasos de condiciones tratadas con LDL de yema de huevo de pollo y sin tratar.
El enriquecimiento de los LDL de la yema de huevo de pollo proporciona una fuente barata de ácidos grasos complejos para investigar las interacciones entre patógenos bacterianos y lipoproteínas de huésped. El cloroformo y el metanol utilizados en la preparación de extractos de lípidos son peligrosos. Por favor, asegúrese de utilizar estos reactivos en una campana de humos químicos y contener todos los flujos de residuos.
