Este protocolo describe un flujo de trabajo para la generación, mantenimiento y análisis óptico de esferoides cardíacos. Estos esferoides cardíacos son esenciales para llenar el vacío en los modelos actuales de enfermedades in vitro. Esta técnica permite a los investigadores crear pruebas de detección de alto rendimiento y almacenamiento funcional de esferoides cardíacos de próxima generación.
Comience agregando un mililitro por centímetro cuadrado de solución estéril de desprendimiento cardíaco a cada pocillo de una placa de cultivo que contenga cardiomiocitos confluentes derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos. Incubar el plato a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Confirme el desprendimiento de células observando células blancas y de forma redonda con un aumento de 4x de un microscopio de campo brillante.
Usando una pipeta de cinco mililitros, disocie mecánicamente las células enjuagándolas con dos mililitros de medio basal caliente para preparar una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar durante tres minutos a 300 g. Luego aspire el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de medios de recubrimiento hiPSC-CM.
Utilice una punta de pipeta de 1.000 microlitros para disociar el pellet celular. Después de tres o cuatro mezclas, como la solución parece homogénea, cárguela en un casete para contar las células y transfiera la cantidad apropiada de células en 100 microlitros de medio de recubrimiento a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo de fijación ultrabaja. Coloque la placa de esferoides cardíacos en un agitador orbital en la incubadora a 70 rpm con una temperatura de 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, 21% de oxígeno y 90% de humedad durante 24 horas.
Para evitar la ruptura del esferoide, aspire solo 50 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 100 microlitros de RPMI más medio B27 por pocillo durante las primeras 48 horas. A continuación, aspire 100 microlitros del medio de cada pozo y agregue 100 microlitros del medio de maduración por pozo. Mantenga las células en el medio de maduración y refresque el medio cada dos o tres días.
Coloque la placa esferoide en hielo durante 10 minutos para el enfriamiento previo antes de centrifugar la placa durante tres minutos a 70 g. Retire el medio hasta que queden 50 microlitros en el pozo. Luego agregue 200 microlitros de medio de congelación hiPSC helado por pozo.
Selle la placa con una película de sellado de placas. Para preparar el molde de silicio, mezcle los componentes del kit de elastómero de silicio en una proporción de 10 a 1 y agregue la solución dentro de la parte inferior de la placa del pozo. Desburbujee la solución con una bomba de vacío durante 15 a 20 minutos.
Coloque el molde en un horno y cúrelo a 60 grados centígrados durante ocho horas para obtener un elastómero semiflexible que se despega de la placa. Coloque la placa sellada cuidadosamente en un molde de silicona, asegurando un intercambio de calor uniforme entre la placa del pozo y el congelador. Congele la placa a 80 grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas en el molde de silicona preparado antes de transferir la placa a un tanque de nitrógeno líquido o a un congelador de 150 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.
Para garantizar una rápida descongelación de los esferoides cardíacos, recoja una placa celular con esferoides cardíacos a la vez del nitrógeno líquido y colóquela en la incubadora durante 15 minutos a 37 grados centígrados, con 5% de dióxido de carbono, 21% de oxígeno y 90% de humedad. Retire la película de sellado de la placa y aspire 150 microlitros de cada pocillo antes de agregar 200 microlitros de un medio basal caliente a cada pocillo. Centrifugar la placa a 70 g durante tres minutos y repetir el lavado medio basal tibio.
Una vez hecho esto, retire 150 microlitros del medio, y agregue 200 microlitros de cardiomiocitos descongelando el medio en cada pocillo. Luego repita el lavado RPMI como se mencionó durante la generación de esferoides cardíacos, seguido de mantener las células en el medio de maduración. Después de una semana del cultivo, los esferoides cardíacos descongelados son óptimos para el manejo de imágenes ópticas de calcio.
Aspirar 150 microlitros de cada pocillo. Trate los esferoides cardíacos descongelados con 100 microlitros de medio de colorante de calcio Cal-520 AM por pocillo en condiciones de oscuridad, e incube la placa durante 60 minutos. Prepare un sistema de adquisición y análisis de calcio alimentando el microscopio y asegurándose de que la opción de control ambiental esté activada.
Ajuste las dimensiones de apertura de la cámara y el encuadre para minimizar el área de fondo. Para medir la señal de calcio, utilizando un láser de 488 nanómetros, establezca el contraste en un fondo negro con una señal verde brillante durante la liberación de calcio. Grabe un video con una transmisión constante de 2 a 10 picos en 10 segundos.
Grabe un video de 10 segundos y escanee a través de la placa de 96 pocillos, inicialmente moviéndose hacia la izquierda, luego hacia abajo en forma de zigzag para cubrir toda la placa. Después de adquirir los transitorios de calcio, analice los datos utilizando un software de análisis de trazas de fluorescencia. Los esferoides cardíacos adquirieron una estructura 3D durante el primer día después de la siembra, que podría cultivarse hasta por seis semanas.
La mayoría de los esferoides cardíacos de tres semanas de edad expresaron una organización regular del sarcómero con alfa actinina y troponina T.Los altos niveles de alfa actinina en el día cero y los esferoides cardíacos de tres semanas indicaron una composición celular constante y altamente pura durante el cultivo. Se observó un aumento de la expresión de los genes cardíacos, desmosomas y mitocondrias en esferoides que en hiPSC-CM cultivados en 2D durante 90 días. El porcentaje de latidos de los esferoides cardíacos fue similar en las primeras tres semanas posteriores a la generación y disminuyó significativamente en la sexta semana debido al deterioro de los esferoides cardíacos.
La tasa de golpes se redujo significativamente en la semana tres en comparación y disminuyó en la semana seis como resultado del deterioro. Los parámetros transitorios de calcio indicaron un valor máximo más alto en la semana dos, mientras que el tiempo de aumento, el tiempo de descomposición y la duración transitoria del calcio al 90% de la descomposición aumentaron significativamente en la semana tres, lo que demuestra que los esferoides derivados de hiPSC-CM fueron funcionalmente óptimos en las semanas dos y tres después de la generación. El tamaño del esferoide aumentó con el número de células utilizadas para la siembra.
En esferoides viejos de mayor tamaño, el latido fue significativamente mayor. Una tasa de latido similar y significativamente más alta fue mostrada por esferoides de 5k, 10k y 20k en comparación con los esferoides de 2.5k. La criopreservación no afectó la viabilidad celular dentro de los esferoides cardíacos.
Una expresión similar de proteínas sarcoméricas en los esferoides descongelados y frescos de la misma edad indicó eficiencia de criopreservación. No hubo cambios significativos en la tasa de latidos de los esferoides cardíacos descongelados o frescos. No se observaron cambios significativos en el tiempo de subida, el tiempo de decaimiento y el CTD90 de CS descongelado o fresco. Además del modelado de enfermedades y las pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento, estos esferoides también se pueden usar para biorreactores de producción de vesículas extracelulares y terapias relacionadas con vesículas extracelulares.
Además, el biobanco de estos esferoides se puede utilizar como un nuevo suministro de cardiomiocitos para estrategias regenerativas. La evidencia acumulada sugiere que los biobancos de modelos de células madre derivadas de pacientes para fibrosis quística, cáncer y esferoides cardíacos tienen un gran potencial para desentrañar los mecanismos moleculares para la detección de medicamentos y para la medicina personalizada.
