La Oficina de Laboratorios de Ciencia e Ingeniería de la FDA está desarrollando herramientas de ciencia regulatoria para ayudar a los desarrolladores de dispositivos médicos y revisores de la FDA. Nuestro objetivo final es acelerar el acceso de los pacientes a dispositivos médicos innovadores, seguros y efectivos a través de la mejor ciencia disponible. En este protocolo, aplicamos tecnología de vanguardia de células madre pluripotentes inducidas a la evaluación de dispositivos médicos que se utilizan para tratar afecciones cardíacas potencialmente mortales.
Esta sencilla herramienta permite la evaluación reproducible de dispositivos de electrofisiología cardíaca en la placa utilizando equipos de laboratorio estándar. También se puede utilizar con células específicas del paciente derivadas de donantes con diversas enfermedades del corazón. Para comenzar, coloque en placa los cardiomiocitos humanos descongelados derivados de iPSC en placas estériles de seis pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% al menos dos días antes de sembrar los cardiomiocitos en el sustrato de hidrogel flexible.
Cultive los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC en medio cardiomiocitos estándar durante dos a cuatro días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para permitirles recuperarse de la criopreservación. Refresque el medio gastado con medio 100% cardiomiocitos cada 48 horas. Verifique el estado de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC antes de la disociación evaluando la salud de las células, asegurando la viabilidad y el latido estable.
Lave los cardiomiocitos con cuatro mililitros por pocillo de DPBS sin cloruro de calcio o cloruro de magnesio. Agregue un mililitro de reactivo de disociación a temperatura ambiente a cada pocillo e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue 10 mililitros de medio cardiomiocitos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros.
Disocie los cardiomiocitos de las placas de seis pocillos con una pipeta de 1, 000 microlitros y agregue la suspensión celular al tubo cónico. Enjuague los pocillos con un mililitro de medio cardiomiocitos fresco para recoger los cardiomiocitos residuales y agréguelos al tubo cónico. Luego lleve el volumen final del tubo cónico a 15 mililitros con el medio.
Centrifugar el tubo a 200 G durante cinco minutos y retirar el sobrenadante hasta la marca de un mililitro. Resuspender las células en el medio cardiomiocitario a un volumen final de cinco mililitros y contar los cardiomiocitos con un contador celular manual o automatizado. A continuación, incubar la suspensión de células de cardiomiocitos durante unos 30 minutos a temperatura ambiente mientras se preparan los sustratos flexibles de hidrogel.
Prepare un juego de pipetas de 20 microlitros a un microlitro, puntas de pipeta, una placa inferior de vidrio estéril de 48 pocillos y un temporizador de cronómetro en la campana de cultivo de tejidos. Mezcle la matriz extracelular o el sustrato de hidrogel a base de ECM golpeando suavemente el tubo y volviéndolo a colocar inmediatamente sobre hielo. Encienda el temporizador del cronómetro inmediatamente antes de revestir el primer sustrato de hidrogel y márquelo como tiempo cero.
Pipetear un microlitro del sustrato de hidrogel hacia arriba y hacia abajo aproximadamente tres veces para enfriar la punta de la pipeta. Luego aplique aproximadamente un microlitro del sustrato de hidrogel sin diluir horizontalmente al fondo de cada pocillo en la placa de 48 pocillos, sosteniendo la pipeta en un ángulo de 45 grados. Coloque todos los sustratos de hidrogel en la misma orientación en cada pocillo para ayudar a identificar el sustrato al realizar los experimentos con un aumento de 40X.
Coloque la tapa en la placa de 48 pocillos y permita que los sustratos de hidrogel se incuben durante ocho a 10 minutos a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejidos antes de agregar las células. Después de la incubación, siembre inmediatamente los cardiomiocitos gota a gota directamente sobre los sustratos de hidrogel con aproximadamente 30, 000 cardiomiocitos viables por pocillo en un volumen medio bajo de aproximadamente 200 microlitros de medio de cardiomiocitos. Después de cerrar la tapa, permita que los cardiomiocitos se incuben sin ser molestados durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente en la campana para permitir que las células se adhieran al sustrato de hidrogel.
Agregue suavemente 100 microlitros de medio cardiomiocitos fresco a cada pocillo. Coloque la placa cerrada de la tapa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro días. Encienda el microscopio y la cámara de control ambiental para equilibrar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Retire el medio cardiomiocitario de la placa de 48 pocillos y enjuague suavemente cada pocillo dos veces con 600 microlitros del medio de ensayo de modulación de contractilidad cardíaca o CCM. Luego agregue 300 microlitros de medio de ensayo CCM por pocillo y coloque la placa de 48 pocillos en el microscopio en la cámara de control ambiental. Inserte los electrodos y equilibre las celdas durante cinco minutos.
Para grabar los videos de contracción usando microscopía basada en video, abra el software de grabación de video y establezca una velocidad de fotogramas de 100 cuadros por segundo. A continuación, seleccione una región de interés o ROI cerca del centro de la monocapa hiPSC-CM. Luego, estimule el campo de las células con un generador de pulsos comercial para marcar el ritmo eléctrico de las monocapas de cardiomiocitos 2D.
Coloque el cardiomiocitos a 1,5 veces el umbral a un hertz con los parámetros de pulso basales. Por ejemplo, pulsos de estimulación de onda cuadrada monofásica con una duración de pulso de estímulo de dos milisegundos de cinco voltios. Grabe el video de contracción de ritmo de referencia antes del CCM durante un mínimo de cinco latidos.
Luego estimulan los cardiomiocitos monocapa con una señal eléctrica experimental de 30 milisegundos de retardo, dos pulsos bifásicos simétricos de 5,14 milisegundos de duración de fase, con 20,56 milisegundos de duración total, 10 voltios de amplitud de fase, e intervalo de interfase cero. Grabe el video de contracción inducida por CCM durante un mínimo de cinco latidos. Apague la señal CCM, estimule con un pulso de ritmo de referencia y grabe un video de contracción del período de recuperación después del CCM durante un mínimo de cinco latidos.
Utilice un software de contracción estándar para analizar los videos de contracción automáticamente y cuantificar las propiedades contráctiles clave como la amplitud de la contracción, la pendiente de la contracción, la pendiente de relajación, el tiempo hasta el pico, el tiempo hasta la línea de base 90% y la duración de la contracción 50%Se caracterizaron las propiedades contractuales monocapa de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC 2D y se cuantificaron los parámetros clave de la contractilidad de los cardiomiocitos. La aplicación de los parámetros estándar de estimulación CCM resultó en propiedades contráctiles mejoradas in vitro. Se evaluaron los efectos de la modulación de las concentraciones extracelulares de calcio sobre las propiedades contráctiles humanas con y sin estimulación CCM.
Se observó la dependencia basal esperada de la contracción del calcio, así como un aumento inducido por CCM en la sensibilidad al calcio a nivel de la monocapa de cardiomiocitos. Además, el interrogatorio farmacológico de la vía de señalización beta androgénica reveló que los efectos inotrópicos inducidos por CCM estaban en parte mediados por la señalización beta adrenérgica. Además, esta herramienta se puede ampliar a los cardiomiocitos de enfermedades específicas del paciente, incluidos los de la miocardiopatía dilatada para comprender el efecto de la MCC en el contexto de los estados de enfermedad.
Aquí, nos centramos principalmente en la evaluación de las propiedades contráctiles humanas. Sin embargo, usando esta herramienta, también se podrían evaluar otras lecturas de acoplamiento de contracción de excitación cardíaca, incluidos los potenciales de acción y el manejo del calcio. Esta es la primera herramienta científica reguladora que combina la tecnología de células madre pluripotentes inducidas con la evaluación de dispositivos cardíacos.
Este método alternativo allana el camino para que los dispositivos médicos se evalúen en un plato y tiene el potencial de reducir la necesidad de pruebas con sujetos animales y humanos.
