El área se considera de interés en cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que este cultivo formó. Describimos nuestra estrategia de encapsulación que conduce a la formación reproducible de esferoides de células madre pluripotentes humanas. Una vez encapsulados, estos esferoides de células madre son susceptibles de cultivo, ya sea en placas de múltiples pocillos o biorreactores agitados.
Nuestra estrategia de encapsulación es optimizar la capacidad de supervivencia de la pestilencia y la alta eficiencia de la formación de esferoides. Los esferoides encapsulados están protegidos contra el cizallamiento o la energía mecánica asociada con la agitación o el balanceo. El desarrollo de células madre derivadas de la terapia celular depende en parte de la capacidad de generar el producto celular deseado de una manera escalable, eficiente y rentable.
La tecnología de encapsulación descrita aquí representa un paso en esta dirección. La tecnología de encapsulación descrita aquí será probablemente aplicable al cultivo 3D de varios tipos de células, desde otras células hasta otras células madre pluripotentes. Comience preparando 30 mililitros de solución madre de dos veces el núcleo mezclando 4.8 gramos de PEG de 35 kilodalton, 10.2 mililitros de medios de gradiente de densidad y 19.8 mililitros de medios DMEM / F-12.
A continuación, filtre esta solución central con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. A continuación, prepare 50 mililitros de aceite mineral con 3 por ciento de surfactante mezclando 48.5 mililitros de aceite mineral y 1.5 mililitros de surfactante. Luego esterilice la solución pasándola a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.
A continuación, prepare soluciones de TDT molar 1, TEA molar y PF127 al 1 por ciento, como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, prepare una emulsión de reticulación mezclando 4,5 mililitros de aceite mineral con un 3 por ciento de surfactante y 300 microlitros de 1 TDT molar. Después de vórtice la solución durante dos minutos, sonicar durante 45 a 60 minutos en un baño ultrasónico a 20 grados centígrados y cargarlo en una jeringa de 5 mililitros con una aguja de calibre 27.
A continuación, prepare la solución de aceite de protección cargando el aceite mineral con un surfactante al 0,5 por ciento en una jeringa de 5 mililitros con una aguja calibre 27. Para preparar la solución de cáscara, agregue 32 miligramos de maleimida PEG4 en 400 microlitros de DPBS. A continuación, añadir 6 microlitros de 1 MOLAR TEA.
Vórtice la solución durante 2 minutos y centrífuga a través de un filtro de centrifugado. Mantenga la solución en la oscuridad en el balancín durante 30 minutos antes de cargarla en una jeringa de 1 mililitro con una aguja calibre 27. Finalmente, prepare la solución de núcleo final volviendo a suspender 20 millones de hPSC en medios de 200 microlitros y mezcle con 30 microlitros de 1 por ciento de PF127 y 200 microlitros de solución de núcleo 2X.
Inserte una pequeña barra agitadora en una jeringa de 1 mililitro. Luego, cargue la célula que contiene la solución central en la jeringa con una aguja de calibre 27. Comience colocando el dispositivo de gotas PDMS adherido, 4 piezas de 20 centímetros de largo y 1 pieza de microtubos de entrada de 5 centímetros de largo, 1 pieza de tubo de salida de 10 centímetros y 6 piezas de tubos de ajuste de 0,5 centímetros debajo de la fuente de luz germicida durante 30 minutos para la esterilización.
Ahora coloque las 4 piezas de microtubos de entrada de 20 centímetros de largo en la carcasa, el aceite, la emulsión de enlace cruzado y las entradas del dispositivo de disociación utilizando fórceps. Luego, inserte el extremo opuesto de los tubos en la aguja de la jeringa con la solución correspondiente. Mientras tanto, conecte la entrada del núcleo de los dispositivos microfluídicos y la salida de los dispositivos de disociación con un microtubo de 5 centímetros.
Inserte 1 tubo de salida en el puerto de salida fluídico y coloque el extremo opuesto en un depósito de recolección. A continuación, coloque el dispositivo en un escenario de microscopio y conecte el tubo para evitar cualquier movimiento. Alinee y enfoque el microscopio en la boquilla del dispositivo para la inspección de flujo.
Coloque cada jeringa en diferentes bombas de jeringa y asegúrela correctamente. Programe cada bomba de acuerdo con los protocolos del fabricante a los caudales mencionados en el manuscrito de texto, e inicie el flujo en todas las bombas. Espere a que cada fluido ingrese al dispositivo y llene los canales mientras expulsa el aire restante.
Cuando la formación de la cápsula se estabilice, coloque el extremo opuesto del tubo de recolección en un nuevo tubo cónico que contenga 5 mililitros de medios mTeSR. Una vez que se hayan recolectado suficientes cápsulas, incube durante 10 minutos. Las cápsulas que residen en la fase de aceite estarán en la parte superior del tubo, que sedimenta hacia la parte inferior al golpear suavemente el tubo.
Para recuperar las cápsulas, comience por eliminar el aceite del tubo de recolección. Luego, coloque las cápsulas en un colador celular de 100 micrómetros de tamaño de poro y lave el colador con grandes cantidades de medios. Invierta el filtro en la parte superior de un pozo de una placa de cultivo de 6 pocillos y recoja las microcápsulas pasando 2 mililitros de medios a través del filtro.
Incubar las cápsulas de células madre en un plato de cultivo de 6 pocillos a 37 grados centígrados con un 5 por ciento de dióxido de carbono. Cambie los medios cada dos días recogiendo las cápsulas en un filtro colador celular, lavándolas con exceso de medios y volviéndolas a suspender a un nuevo pozo en placas de 6 pocillos con medios de 2 mililitros. Realizar el ensayo de viabilidad añadiendo 4 microlitros de los 2 micromolares Ethidium Homodimer-1 y 1 microlitro de las 4 soluciones micromolares de Calceína-AM a 2 mililitros de DPBS estériles.
Vórtice para asegurar una mezcla completa. Recolecte aproximadamente 100 microcápsulas en un colador celular y enjuáguelas con DPBS estériles para permitir la difusión del medio de las cápsulas. Recójalos nuevamente en una placa de cultivo de 12 pocillos usando 1 mililitro de la solución preparada que contiene Ethidium Homodimer-1 y calceína AM e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos.
Visualice las células bajo un microscopio de fluorescencia. Las microcápsulas óptimas y subóptimas fabricadas mediante la generación de gotas microfluídicas mostraron diferencias en la morfología de la cápsula en función del contenido de PEG4-Maleimida en la cáscara. Las cápsulas lisas con bordes brillantes se asocian con la integridad mecánica deseada.
La agregación de cuentas en el centro de las cápsulas indica que el núcleo era acuoso y las cuentas eran libres de moverse. El anillo fluorescente indicó la presencia de una cáscara de hidrogel y se utilizó para determinar el grosor de la cáscara. Las tinciones vivas o muertas 6 horas después de encapsular las células H9 mostraron que las células lograron más del 95 por ciento de viabilidad de forma rutinaria durante las ejecuciones de encapsulación.
Al comparar la tasa de crecimiento y el potencial de diferenciación de los esferoides encapsulados frente a los no encapsulados. Se determinó que el proceso de encapsulación no tiene efectos adversos sobre las hPSC. Recuerde que es importante establecer una relación de caudal óptima entre la carcasa del núcleo y las corrientes de aceite.
No hacer esto puede resultar en cápsulas que no serán mecánicamente fuertes y pueden romperse durante la manipulación. Nos gustaría señalar que esta técnica de encapsulación fue para tipos de células distintas de las células madre pluripotentes humanas. Hemos encapsulado, principalmente hipotetizados, líneas celulares de cáncer y células madre mesenquimales utilizando una estrategia similar.
Actualmente, nuestro equipo está desarrollando la próxima generación de microcapturas. Estas microcapturas son bioactivas y pueden estar cargadas con factores cruzados para la diferenciación encapsulada de células madre.
