La estrategia para excluir neuronas utilizando la clasificación negativa de FACS genera tasas de secuenciación de ARN de alta calidad de población celular de baja abundancia, como células madre neurales, astrocitos y oligodendrocitos, para estudiar su papel en la modulación de la neurogénesis del hipocampo adulto. Con este método, es posible adaptar la elección del anticuerpo en el sistema de control de los datos sobre el terreno, lo que hace que este protocolo sea muy versátil para abordar diversas cuestiones biológicas relacionadas con el giro dentado. Este método está diseñado principalmente para investigar el nicho del hipocampo adulto.
Sin embargo, podría adaptarse fácilmente para estudiar otros nichos de células madre. Demostrando el procedimiento estará Sara Ahmed de Prado, becaria de formación postdoctoral en el Instituto Francis Crick. Para comenzar, transfiera el cerebro diseccionado del ratón sacrificado a una placa de Petri de 10 centímetros llena de PBS helado.
Luego coloque la placa de Petri en hielo y corte el cerebro en dos mitades a lo largo del eje sagital. Con un bisturí, retire el cerebelo. Transfiera la mitad del cerebro a la nueva placa de Petri de 10 centímetros colocada en hielo, que contiene PBS helado.
Disecciona el giro dentado, o DG, usando binoculares, y repite este paso para obtener el segundo DG de la segunda mitad del cerebro. Transfiera los dos DG al homogeneizador Dounce preenfriado y agregue 1 mililitro de tampón de homogeneización en frío, o HB. Homogeneice el tejido con 10 golpes del mortero A suelto, seguido de 15 golpes del mortero B apretado. Transfiera el homogeneizado a un tubo preenfriado de 15 mililitros.
Enjuague el homogeneizador Dounce con 1 mililitro de HB frío y combínelo con el mismo tubo. Agregue 3 mililitros de HB al tubo de 15 mililitros e incube durante 5 minutos en hielo. Mezcle esta suspensión de núcleos dos veces invirtiendo el tubo suavemente.
Usando 0.5 mililitros de HB, humedezca previamente la tapa del filtro de 70 micrómetros colocada sobre un tubo de ensayo de 50 mililitros, luego cuele la suspensión de los núcleos antes de lavar el filtro celular con 0.5 mililitros de HB. A continuación, retire el filtro celular y centrifugue el tubo de ensayo en una centrífuga de cubo oscilante a 500 x g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante. Resuspenda suavemente el pellet en 4 mililitros de HB con una pipeta P1000.
Después de 5 minutos de incubación en hielo, centrifugar la suspensión a 500 x g durante 10 minutos, a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mililitros de medios de lavado. Use 0,5 mililitros de medios de lavado para humedecer previamente una tapa de filtro de 35 micrómetros sobre un tubo de ensayo de 50 mililitros.
Luego cuele la suspensión de núcleos pipeteando 0,5 mililitros de suspensión a la vez, usando una pipeta P1000. Después de lavar la tapa del filtro con 0,5 mililitros de medios de lavado, coloque el tubo sobre hielo. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de 15 mililitros y centrifugarlo durante 5 minutos y 4 grados centígrados, a 500 x g.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 mililitros de medios de lavado. Repita la centrifugación y resuspenda el pellet en 1 mililitro de medio de lavado con el anti-NeuN de ratón, el anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 y 1 microgramo por mililitro DAPI. Incubar la reacción durante 45 minutos en hielo en la oscuridad.
Para la clasificación de núcleos activados por fluorescencia, o FANS, transfiera la suspensión de núcleos inmunoteñidos a un tubo de ensayo de 5 mililitros y colóquela en hielo hasta el inicio del procedimiento de citometría de flujo. Vortex las muestras durante 3 segundos, con intensidad suave, antes de colocar los tubos en el instrumento FACS. Para adquirir los datos de la suspensión de núcleos teñidos, establezca las puertas en altura DAPI y el área DAPI para excluir los restos celulares y los núcleos agregados.
Luego configure las puertas en el área de dispersión del lado del registro, o SSC, y el área de dispersión directa del registro, o FSC, para separar los núcleos individuales del agregado teñido DAPI restante o los desechos celulares. Luego aísle a la población NeuN-AF488-negativa estableciendo las puertas para el área anti-NeuN-AF488 y FSC. Después del análisis, clasifique la población negativa anti-NeuN-AF488 en un tubo de recolección de 1,5 mililitros lleno de 50 microlitros de medios de lavado utilizando la estrategia de compuerta.
Una vez que se haya realizado la clasificación, agregue 1 mililitro de PBS que contenga 1% de albúmina sérica bovina, o BSA, al tubo de recolección para recolectar gotas de la pared del tubo y centrifugar el tubo a 500 x g, durante 5 minutos, a 4 grados centígrados. Desechar el sobrenadante, dejando 50 microlitros de soluto para resuspender los núcleos centrífugos. En un microtubo de 0,5 mililitros, agregue 5 microlitros de la suspensión de núcleos a 5 microlitros de azul de tripano.
Mida la concentración y evalúe la viabilidad de la suspensión de una sola célula utilizando un contador de células automatizado antes de realizar la preparación de la biblioteca y la secuenciación de los núcleos. La agrupación bioinformática reveló grupos bien separados de núcleos correspondientes a tipos celulares conocidos dentro de la DG, con o sin FANS. Dentro de la muestra no clasificada por FACS, la mayoría de los núcleos secuenciados de alta calidad eran el 84,9% de las neuronas.
Se compone de tres grupos de neuronas, lo que indica la posibilidad de que las poblaciones celulares más representativas en el giro dentado sean neuronas granulares, otras neuronas excitadoras y neuronas inhibidoras. Dentro de la muestra no clasificada por FACS, los grupos no neuronales identificados estaban formados principalmente por 11.1% de tipos de células gliales, incluidos astrocitos, oligodendrocitos y células precursoras de oligodendrocitos, 3.3% de células inmunes y 0, 6% de células de Cajal-Retzius. Mientras realizaban FANS para excluir poblaciones NeuN positivas, los grupos de células gliales se hicieron prominentes, con el 81,3% del total de núcleos.
Para las muestras secuenciadas a 50.000 lecturas por núcleo, se detectaron 25.010 genes por núcleo para la muestra no clasificada por FACS, y 1.665,5 genes para la muestra FANS NeuN-negativo, lo que confirma que el perfil transcriptómico de alta calidad de núcleos individuales y la clasificación FACS no daña los núcleos para el posterior snRNA-seq. La alta proporción de neuronas en la muestra no clasificada por FACS tuvo una mayor actividad transcripcional de 2.660 genes por núcleo y 6.170 transcripciones por núcleo en la muestra no clasificada por FACS que los tipos de células no neuronales con una actividad transcripcional promedio de 1.090 genes por núcleo y 1.785 transcripciones por núcleo. Una vez que se han generado los datos con este protocolo, vale la pena considerar estos nuevos métodos ortogonales como los síntomas especiales o los estudios in vivo para validar cualquier hallazgo.
