Más del 50% de los pacientes con cáncer colorrectal desarrollan metástasis hepáticas a través de la diseminación de la vena porta. Y los modelos animales actuales para estudiar la metástasis hepática del cáncer colorrectal siguen siendo inadecuados para recapitular el proceso biológico. La inyección de tumoroides de cáncer colorrectal en la vena porta proporciona un entorno tumoral rico en fibroblastos que permite la investigación de la diafonía entre las células cancerosas metastásicas y el CAS en la metástasis hepática del cáncer colorrectal.
Esta técnica proporciona una plataforma para evaluar la eficacia de las estrategias terapéuticas dirigidas al microambiente tumoral de la metástasis hepática del cáncer colorrectal. Este método es particularmente útil para investigar las interacciones entre CAS, las células tumorales y el microambiente tumoral. Si la punta de algodón no se coloca correctamente en el sitio de la inyección, puede ocurrir sangrado excesivo después de la extracción de la aguja.
El remojo de la punta de algodón se detiene una vez que se encuentra el sitio de inyección. Identificar la vena porta y visualizar el sitio de inyección puede ser difícil sin la demostración visual de este procedimiento. Para comenzar, prepare un área quirúrgica aséptica con cortinas estériles en una almohadilla térmica.
Además, prepare todos los instrumentos necesarios para la cirugía como se describe en el manuscrito de texto. Luego ilumine el área quirúrgica ajustando la posición de la fuente de luz. A continuación, inyecte por vía subcutánea 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal de buprenorfina en un ratón para el manejo quirúrgico del dolor.
Luego anestesia al ratón y usando una afeitadora eléctrica, afeita el medio hasta la parte superior del abdomen en un área distante del área quirúrgica aséptica para evitar que el cabello contamine el sitio. Limpie el sitio de la incisión alternando con Betadine y etanol al 80% para esterilizar el área quirúrgica. Repetir tres veces.
Coloque el ratón en el área quirúrgica sobre una almohadilla térmica en posición supina con mantenimiento de anestesia isoflurano. Luego coloque una cortina quirúrgica con un orificio sobre su abdomen. Levante la piel abdominal con fórceps y haga una incisión cutánea de dos a tres centímetros en la línea media con tijeras, cortando solo la piel, asegurándose de que la incisión vaya desde la mitad del abdomen hasta el proceso xifoide del esternón y no por encima del extremo inferior del proceso xifoide.
Luego levante completamente la pared peritoneal con fórceps y haga una incisión similar de dos a tres centímetros en el peritoneo con tijeras. Evite cortar el intestino y el diafragma. A continuación, remoje una gasa quirúrgica con solución salina tibia y colóquela junto a la incisión a la derecha del cirujano.
Extraiga suavemente los intestinos delgado y grueso con un bastoncillo de algodón empapado con solución salina y colóquelos en la gasa empapada en solución salina. Cubra los intestinos con una gasa húmeda adicional para mantenerlos húmedos. A continuación, tire suavemente del intestino hacia la derecha del cirujano con la gasa húmeda.
Luego aplique una tensión suave para visualizar la vena porta. Si la visualización de la vena porta es difícil, ajuste suavemente la posición del estómago con un bastoncillo de algodón húmedo. Después de canalizar suavemente la suspensión tumoroide varias veces para obtener una suspensión celular homogénea, extraiga 100 microlitros de la suspensión celular en una jeringa Hamilton o de un mililitro unida a una aguja de calibre 33, evitando burbujas de aire.
Inserte lentamente el bisel de la aguja en la vena porta con una profundidad de inserción de tres a cuatro milímetros y el ángulo de la aguja casi paralelo a la vena porta. Inyecte las células tumorales lentamente durante 30 segundos para evitar la oclusión de la vena porta. El color del hígado cambia temporalmente de rojo a blanco.
Después de la inyección, retire la aguja lentamente e inmediatamente aplique una presión suave en el lugar de la inyección con un bastoncillo de algodón seco durante cinco minutos. Retire el bastoncillo de algodón e inmediatamente aplique una esponja hemostática en el lugar de la inyección. Sostenga la esponja con un bastoncillo de algodón o fórceps y aplique una presión suave durante cinco minutos más.
Después de cinco minutos, retire la presión a la esponja hemostática y confirme que no hay sangrado del sitio de la inyección. Si se produce sangrado, realice inmediatamente la hemostasia a presión con un bastoncillo de algodón durante unos 10 minutos. Luego aplique una esponja hemostática adicional durante otros cinco minutos.
Después de confirmar que no hay sangrado, retire las gasas quirúrgicas en los intestinos. Luego, usando una jeringa llena de cinco mililitros de solución salina, vierta la solución salina a los intestinos para evitar la adhesión de los órganos. Coloque suavemente los intestinos dentro de la cavidad abdominal y suture el peritoneo usando 4-0 suturas de poliglactina.
Luego levantando ambos lados de la piel con fórceps, aplique grapadoras de piel para cerrar la incisión de la piel, teniendo cuidado de no grapar el intestino. Apague el isoflurano, pero mantenga el flujo de oxígeno en funcionamiento. Controle cuidadosamente el ratón.
Y cuando el ratón se despierte, colóquelo en una jaula vacía en una almohadilla térmica. Monitoree al ratón hasta que esté consciente y deambulando normalmente. Cuatro horas después de la cirugía, inyecte por vía subcutánea 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina.
Controle cuidadosamente al ratón diariamente durante una semana, revisando las suturas y la cicatrización de heridas. De siete a 10 días después de la cirugía, retire las grapadoras de piel con un removedor de grapadora. La hibridación de ARN in situ dos semanas después de la inyección de AAV-8 Islr en la vena de la cola mostró una sobreexpresión de Islr en el hígado.
Dos semanas después de la inyección de AAV mRuby2, se inyectaron suspensiones unicelulares de organoides de cáncer de colon en la vena porta del ratón. Macroscópicamente, esta inyección de vena porta dio lugar a múltiples nódulos tumorales blancos en el hígado. La tinción de hematoxilina y eosina del cáncer colorrectal inducida por la inyección de vena porta demostró histopatología de adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado acompañado de una reacción estromal desmoplástica y necrosis.
Esta histología rica en estroma recapituló fielmente la de las metástasis hepáticas del cáncer colorrectal humano, lo que hace que este modelo sea adecuado para la investigación traslacional que investiga el estroma tumoral metastásico. La inmunohistoquímica para la actina del músculo liso alfa confirmó la presencia de fibroblastos asociados al cáncer, mientras que la tinción roja de Picro-Sirius demostró abundante matriz extracelular en el mesénquima tumoral. La inmunoquímica para EPCAM reveló que el cáncer colorrectal metastásico mostró brotación tumoral, que es una característica del cáncer colorrectal de mal pronóstico.
Y el índice de etiquetado Ki67 fue de aproximadamente el 80%, lo que indica que la mayoría de las células tumorales son mitóticamente activas. Los ratones mostraron una mediana de supervivencia de 57 días después de la inyección de tumoroides en la vena porta. Los ratones tratados con AAV-8 Islr mostraron una mejor supervivencia de los ratones, una disminución de las señales de imágenes in vivo de los tumores, una mayor señalización de proteínas morfogenéticas óseas y una disminución de las células proliferantes de Ki67.
Asegúrese de que la punta de algodón se aplique en el sitio de inyección correcto y que la esponja hemostática se aplique solo después de que el sangrado se haya detenido. El establecimiento del tumor se puede monitorear utilizando las imágenes IVIS para asegurarse de que las células tumorales están creciendo dentro del hígado.
