Este método ayuda a observar la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente perceptible celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente. La mitofagia juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de las mitocondrias y varios aspectos de la función celular. Esta técnica podría proporcionar un nuevo enfoque para el tratamiento de enfermedades relacionadas con las mitocondrias.
Este procedimiento no es muy complicado. La captura de imágenes claras es muy importante para contar la superposición de mitocondrias y lisosomas. Para comenzar, cultive fibroblastos embrionarios de ratón o células MEF en una placa de cultivo celular de 10 centímetros con 10 mililitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM.
Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y monitorear las células bajo un microscopio a un aumento de 100X. Cuando las células alcancen 80 a 90% de confluencia, lávelas con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Luego agregue dos mililitros de 0.05% tripsina EDTA durante un minuto para disociar las células, seguido de dos mililitros de DMEM para detener la reacción.
Centrifugar la suspensión celular a 100 G durante tres minutos y volver a suspender el pellet en un mililitro DMEM. Cuente las células usando un contador celular automatizado y portaobjetos de cámara de conteo celular e inocule 1.5 veces 10 a la sexta celda en un nuevo plato de cultivo celular de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM. Para el ensayo de mitofagia, prepare una suspensión celular como se describe y diluya la suspensión celular a una vez de 10 a la quinta célula por mililitro de DMEM fresco.
Agregue dos mililitros de la suspensión de celda diluida a una placa confocal de 20 milímetros y agite la placa en una cruz. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Preparar soluciones de trabajo de los colorantes diluyendo las soluciones madre.
Agregue dos microlitros de colorante mitocondrial de 0,2 milimolares y 50 de colorante lisosómico micromolar a dos mililitros de DMEM para obtener una concentración de trabajo de 0,2 colorante mitocondrial micromolar y 50 colorante lisosómico nanomolar. Retire el medio de la placa de cultivo confocal y agregue un mililitro de la solución de tinción para cubrir las células. Coloque la placa de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos.
Establezca los parámetros del software de imágenes de microscopía confocal. Para imágenes de excitación dual, use excitación secuencial a 488 nanómetros y 543 nanómetros y recoja la emisión a 505 a 545 nanómetros y más de 560 nanómetros respectivamente. Retire el plato de medio de cultivo que contiene el tinte de la incubadora y agregue un mililitro de tampón Krebs-Henseleit o KH al plato.
Para inducir la mitofagia, trate las células con FCCP en un micromolar en tampón KH durante 10 minutos a temperatura ambiente e inmediatamente proceda a obtener imágenes de las células con el microscopio confocal. Aplique una cantidad adecuada de aceite en la parte superior de la lente de aceite 63X. Coloque la muestra en la etapa de muestra del microscopio confocal y muévala directamente sobre la lente del objetivo.
Utilice el software de imágenes para encontrar la muestra haciendo clic en la pestaña Localizar en la esquina superior izquierda de la interfaz del software. Seleccione un conjunto de filtros verdes para el experimento. Utilice la perilla de ajuste gruesa para enfocar rápidamente moviendo la lente del objetivo hacia arriba y hacia abajo.
Después de que la muestra de células sea claramente visible a través del ocular, busque y enfoque el área de celdas individuales y muévala al centro del campo de visión. Haga clic en la pestaña Adquisición en la esquina superior izquierda de la interfaz del software para adquirir imágenes. Seleccione solo el canal de 488 nanómetros y la resolución de fotogramas 1024 por 1024 para obtener una vista previa.
Haga clic en la pestaña En vivo en la esquina superior izquierda para iniciar un escaneo en vivo. Ajuste el campo de visión al máximo y ajuste la potencia del láser moviendo el control deslizante hacia la izquierda o hacia la derecha. Mantenga el ajuste de ganancia por debajo de 600 para evitar la sobreexposición.
Ajuste el valor del agujero de alfiler a 156, el valor de ganancia a 545 y el valor de desplazamiento digital a cero. Seleccione el mejor campo de visión, verifique los dos canales y elija la resolución de cuadro 1024 por 1024. Haga clic en Ajustar para adquirir imágenes 2D y guardar las imágenes adquiridas.
En este estudio, FFCP se utilizó para desencadenar la mitofagia en células MEF para imágenes confocales. Aquí se muestran imágenes representativas de células teñidas con el colorante mitocondrial verde-fluorescente que muestra mitocondrias y teñidas con el colorante lisosómico fluorescente rojo que muestra lisosoma. Cuando las mitocondrias dañadas teñidas de verde son engullidas por lisosomas teñidos de rojo, la fluorescencia verde y roja se superponen para revelar lisosomas mitocondriales colocalizados amarillos.
Los puntos amarillos corresponden a estos lisosomas mitocondriales colocalizados que representan la mitofagia en curso y, por lo tanto, se pueden contar para evaluar la extensión de la mitofagia. La preparación de una solución funcional de colorantes para la tinción de mitocondrias y lisosomas y el mantenimiento de la confluencia celular adecuada cuando se obtienen imágenes con microscopía confocal son pasos clave para recordar. Este procedimiento también se puede utilizar para analizar el número mitocondrial y la morfología, que es importante para evaluar la dinámica mitocondrial.
La mitofagia está estrechamente asociada con una variedad de enfermedades humanas y esta técnica se puede utilizar para explorar la conexión entre la mitofagia y las enfermedades humanas.
