El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo del TPFS específico del virus de la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares. La demostración del procedimiento será realizada por Linlin Zhang y Meng Zhang, dos estudiantes de nuestro laboratorio. Para comenzar, estimule las PBMC del grupo de estimulación JEV con partículas JEV inactivadas concentradas durante 16 horas a 37 grados centígrados en presencia de anticuerpos monoclonales, CD28 y CD49d, CD107a, GolgiPlug y monensina.
Luego, estimular las PBMC del grupo control sin partículas virales concentradas durante 16 horas a 37 grados centígrados en presencia de anticuerpos monoclonales, CD28 y CD49d, CD 107a, GolgiPlug y monensina. Recoja la suspensión celular de cada grupo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con una pipeta.
Resuspender las células en 1 mililitro de PBS. Agregue un tinte de viabilidad reparable a la suspensión celular e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar a 500 g a temperatura ambiente durante cinco minutos y retirar el sobrenadante.
Después de resuspender las células en 1 mililitro de PBS, nuevamente, centrifugar a 500 g a temperatura ambiente durante cinco minutos y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Para realizar la tinción del marcador de superficie celular, resuspenda las células en 100 microlitros de PBS y agregue dos microlitros de cada anticuerpo marcador de superficie a la suspensión celular en cada tubo. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras los protege de la luz.
Centrifugar a 500 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Nuevamente, resuspenda las células en un mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con cuidado.
Para realizar la fijación y la rotura de la membrana, resuspenda las células con 500 microlitros de solución fijadora que rompe la membrana y fije las células durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar a 500 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante. Después de resuspender las células en un mililitro de PBS, centrifugar durante cinco minutos a 500 g a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado, como se demostró anteriormente.
Luego, resuspenda las células en 100 microlitros de PBS y agregue dos microlitros de cada anticuerpo de citoquinas a la suspensión celular en cada tubo para la tinción intracelular de citoquinas. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Nuevamente, centrifugar a 500 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante como se demostró anteriormente.
Una vez más, resuspender las células en un mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado como se demostró anteriormente. Luego, agregue 500 microlitros de PBS para resuspender las células.
Después de aislar solo la muestra de PBMC, como se demostró anteriormente, divida la suspensión celular en 12 partes iguales en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros descritos en el manuscrito. Del mismo modo, después de agregar los marcadores de superficie celular y el anticuerpo de citoquinas intracelulares, como se demostró anteriormente, agregue 500 microlitros de PBS para resuspender las células y el vórtice con baja velocidad. Usando una muestra no teñida, ajuste la dispersión directa, la dispersión lateral y diferentes voltajes de colorante fluorescente, mientras ajusta la compensación de citometría de flujo para eliminar las señales de contaminación entre los diferentes fluoróforos, utilizando las muestras de tinción únicas.
Dibuje una puerta poligonal a través del área de dispersión hacia adelante, el diagrama de puntos del área de dispersión lateral para seleccionar la población de linfocitos intacta, excluyendo los desechos, y una puerta rectangular a través del área de dispersión hacia adelante, un diagrama de puntos de ancho de dispersión hacia adelante para seleccionar las celdas individuales. A continuación, dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos de área de dispersión del lado muerto vivo para seleccionar las celdas vivas, y una puerta rectangular a través del diagrama de puntos del área de dispersión lateral CD3 para identificar las tres células T positivas del CD. Luego, dibuje una puerta cuádruple a través del diagrama de puntos CD4, CD8 para identificar las células T CD4 positivas o CD8 positivas y a través del diagrama de puntos CD45RO, CD27 para subdividir las células T CD4 positivas o CD8 positivas en MTC y TEM.
Después de dibujar las puertas de CD107a, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa, interleucina 2 y proteína inflamatoria de microfagos una alfa de la MTC o TEM de las células T CD8 positivas o CD4 positivas para determinar la frecuencia de diferentes patrones de respuesta respectivamente. Cargue las muestras en la citometría secuencialmente. La estrategia de compuerta se empleó para identificar la MTC o TEM de las células T CD8 positivas o CD4 positivas y sus subconjuntos utilizando el ancho del área de dispersión hacia adelante, luego el diagrama de puntos del área de dispersión lateral.
La caracterización polifuncional de las respuestas de células T CD4 positivas y CD8 positivas a JEV indicó que se detectaron niveles aumentados de CD107a, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa e interleucina 2 en las células TCM CD8 positivas de los niños vacunados después de la estimulación JEV en comparación con aquellos en niños no vacunados. Sin embargo, el nivel de proteína inflamatoria de macrófagos uno alfa no difirió entre los dos grupos. Se detectaron niveles más altos de CD107a e interferón gamma en las células TEM CD8 positivas del grupo vacunado bajo estimulación JEV en comparación con el grupo no vacunado.
Mientras que el factor de necrosis tumoral alfa, la interleucina 2 y la proteína inflamatoria de macrófagos uno alfa, no estaban significativamente elevados en esas células positivas. El antígeno JEV indujo con éxito niveles más altos de CD107a, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa y proteína inflamatoria de macrófagos uno alfa en las células CD4 positivas para la MTC del grupo vacunado en comparación con el grupo no vacunado. Sin embargo, la proporción de células positivas para interleucina 2 no difirió entre los dos grupos bajo estimulación JEV.
La proporción de subconjuntos CD107a positivos, interferón gamma positivos y factor de necrosis tumoral alfa positivo, células TEM sub CD4 positivas en el grupo vacunado fue mayor en presencia de JEV que en el grupo no vacunado. La inmunogenicidad de las células T de los estímulos y las estrategias de coincidencia de color compatibles son pasos críticos en este protocolo.
