Este protocolo ayudará en la determinación de la actividad de las proteínas ATPasa mediante la medición del fosfato libre resultante de la hidrólisis de ATP por las proteínas. El ensayo de verde de malaquita es un procedimiento simple, sensible, rápido y económico para la detección de fosfato inorgánico. Es adecuado para la automatización y el cribado de alto rendimiento de compuestos contra su objetivo.
Esta técnica jugará un papel importante en el rápido descubrimiento de inhibidores contra la proteína Hsp90, que es un importante objetivo anticancerígeno. Para comenzar, pipetear 40 microlitros de fosfato estándar de un milimolar en 960 microlitros de agua ultrapura para obtener una solución de fosfato de 40 micromolares. Agregue esta solución según las instrucciones del fabricante para formar una dilución en serie de fosfato de 0 a 40 micromolar.
A continuación, use ocho microlitros de levadura Hsp90 para una actividad de ATPasa medible. Agregue el reactivo verde de malaquita al blanco y al control positivo, y verifique que la diferencia de densidad óptica entre el blanco y el control positivo después de la adición sea al menos 0.5 e inferior a 1. Para preparar ATP, transfiera un miligramo de ATP a un vial que contenga 453,39 microlitros de agua ultrapura para obtener una solución madre de cuatro milimolares.
Prepare el ATP fresco, ya que puede hidrolizarse espontáneamente con el tiempo. Agregue cuatro microlitros de solución madre de ATP a cada pocillo para obtener una concentración final del pozo de 0.2 milimolar. Agregue ATP como último componente a la reacción usando una pipeta multicanal para que todas las reacciones comiencen simultáneamente.
A continuación, prepare un stock de 10 milimolares de geldanamicina disolviendo un miligramo en 178.37 microlitros de DMSO. Usando la solución madre, prepare una solución 4-milimolar, 0.8 milimolar, 0.16-milimolar, 0.032-milimolar, 0.0064-milimolar y 0.00128-milimolar en DMSO por dilución seriada. Agregue dos microlitros de estas soluciones madre a cada pocillo para obtener una concentración final de pozo de 0.1-milimolar, 0.02-milimolar, 0.04-milimolar, 0.0008-milimolar, 0.00016-milimolar y 0.000032-milimolar.
Luego, prepare los pozos junto con los pozos que contienen el control en blanco y negativo. Los pocillos que contienen geldanamicina sirven como control positivo. Prepare las placas de 96 pocillos y prepare un pocillo separado para los compuestos que muestran absorbancia a 620 nanómetros para registrar la absorbancia en esta longitud de onda.
No muestre un pocillo separado para geldanamicina, ya que la geldanamicina no muestra absorbancia a 620 nanómetros para la concentración utilizada en este ensayo. Establezca pozos de ensayo agregando agua ultrapura a cada pozo. Luego, agregue la cantidad requerida de tampón de ensayo y una solución compuesta como la solución de geldanamicina.
Agregue Hsp90 a los pocillos apropiados y agite las placas durante dos minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente. Añadir cuatro microlitros de solución de ATP con una pipeta multicanal. Envuelva la placa en papel de aluminio y agite durante dos minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente a 200 rpm.
Incubar el plato a 37 grados centígrados durante tres horas. Detenga la reacción agregando 20 microlitros de reactivo verde de malaquita en el mismo orden que el ATP usando una pipeta multicanal e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, mida la absorbancia de la placa a 620 nanómetros en un lector de placas.
Además de la placa A, agregue 90 microlitros de tampón de ensayo en cada pocillo. Además de la placa B, agregue 90 microlitros de tampón con Hsp90 en cada pocillo. Además de la placa C, agregue 90 microlitros de ATP, y además la placa D agregue 90 microlitros de reactivo verde de malaquita en cada pozo.
Utilice un sistema automatizado de dispensación multicanal para transferir 40 microlitros de solución de cada pocillo de adición de la placa A a las placas principales uno y dos, y de la placa B a la placa principal tres y cuatro. Transfiera 20 microlitros de la solución de cada pocillo de la placa compuesta a las placas principales uno, las placas principales dos, las placas principales tres y las placas principales cuatro. Agite los platos durante un minuto en una coctelera a 200 rpm.
Transfiera 20 microlitros de la solución de cada pocillo de las placas de adición C a las placas principales uno, dos, tres y cuatro. Agite los platos durante un minuto en una coctelera a 200 rpm. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante tres horas y luego transferir 20 microlitros de reactivo verde de malaquita de la placa de adición D a los pocillos de las placas principales uno, dos, tres y cuatro.
Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, mida la absorbancia de la placa a 620 nanómetros en un lector de placas. Aquí se muestra la estructura del verde de malaquita y las reacciones del reactivo verde de malaquita A con fosfato libre y la reacción posterior con el reactivo B. En esta figura se representa una gráfica estándar para la concentración estándar de fosfato.
Aquí, el eje x representa la concentración de fosfato libre o pi en micromolar, y la absorbancia a 620 nanómetros se representa en el eje y. Las barras de error representan la desviación entre los dos números de muestra. El porcentaje de actividad ATPasa se utiliza para medir la inhibición dependiente de la dosis de la proteína por geldanamicina.
Se observó que la geldanamicina inhibió la proteína de manera dosis-dependiente con un valor IC50 de 0,85-micromolar. Aquí, cada punto es una media de dos determinaciones. El desarrollo del color en la placa principal uno después de la adición del agente verde malaquita se muestra en esta imagen.
El color rosa en el pozo A11 se debe al color compuesto. Del mismo modo, el desarrollo del color en la placa principal dos se muestra aquí. El color rosa en el pozo A11 se debe a la naturaleza coloreada del compuesto.
Aquí se muestra el desarrollo del color después de la adición del reactivo verde malaquita en la placa principal tres y en la placa principal cuatro. La adición de ATP y reactivo verde de malaquita en el mismo intervalo de tiempo a cada pocillo es algo importante para recordar al intentar este procedimiento.
