Este protocolo auxiliará na determinação da atividade das proteínas ATPase através da mensuração do fosfato livre resultante da hidrólise do ATP pelas proteínas. O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico. É adequado para automação e triagem de alto rendimento de compostos contra seu alvo.
Esta técnica desempenhará um papel importante na rápida descoberta de inibidores contra a proteína Hsp90, que é um importante alvo anticâncer. Para começar, pipetar 40 microlitros de fosfato padrão de um milimolar em 960 microlitros de água ultrapura para obter solução de fosfato de 40 micromolares. Adicione esta solução de acordo com as instruções do fabricante para formar uma diluição em série de fosfato de 0 a 40 micromolares.
Em seguida, use oito microlitros de levedura Hsp90 para atividade ATPase mensurável. Adicionar o reagente verde de malaquita ao branco e ao controlo positivo e verificar se a diferença de densidade óptica entre o branco e o controlo positivo após a adição for pelo menos 0,5 e inferior a 1. Para preparar ATP, transfira um miligrama de ATP para um frasco contendo 453,39 microlitros de água ultrapura para obter a solução-estoque de quatro milimolares.
Prepare o ATP fresco, pois ele pode hidrolisar espontaneamente com o tempo. Adicione quatro microlitros de solução estoque de ATP a cada poço para obter uma concentração final do poço de 0,2 milimolar. Adicione ATP como o último componente à reação usando uma pipeta multicanal para que todas as reações comecem simultaneamente.
Em seguida, prepare um estoque de 10 milimolares de geldanamicina dissolvendo um miligrama em 178,37 microlitros de DMSO. Usando a solução reserva, prepare soluções de 4 milimolares, 0,8 milimolares, 0,16 milimolares, 0,032 milimolares, 0,0064 milimolares e 0,00128 milimolares em DMSO por diluição seriada. Adicione dois microlitros dessas soluções-estoque a cada poço para obter uma concentração final de 0,1-milimolar, 0,02-milimolar, 0,04-milimolar, 0,0008-milimolar, 0,00016-milimolar e 0,000032-milimolar.
Em seguida, prepare os poços juntamente com os poços contendo o controle branco e negativo. Os poços contendo geldanamicina servem como controle positivo. Prepare as placas de 96 poços e prepare um poço separado para os compostos que mostram absorbância em 620 nanômetros para registrar a absorbância neste comprimento de onda.
Não mostre um poço separado para geldanamicina, pois a geldanamicina não mostra absorbância a 620 nanômetros para a concentração usada neste ensaio. Configure poços de ensaio adicionando água ultrapura a cada poço. Em seguida, adicione a quantidade necessária de tampão de ensaio e uma solução composta, como solução de geldanamicina.
Adicione Hsp90 aos poços apropriados e agite as placas por dois minutos em um agitador de placas à temperatura ambiente. Adicione quatro microlitros de solução ATP usando uma pipeta multicanal. Embrulhe a placa em papel alumínio e agite por dois minutos em um agitador de placas à temperatura ambiente a 200 rpm.
Incubar a placa a 37 graus Celsius por três horas. Pare a reação adicionando 20 microlitros de reagente verde de malaquita na mesma ordem do ATP usando uma pipeta multicanal e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, meça a absorbância da placa a 620 nanômetros em um leitor de placas.
Além da placa A, adicione 90 microlitros de tampão de ensaio em cada poço. Além da placa B, adicione 90 microlitros de tampão com Hsp90 em cada poço. Além da placa C, adicione 90 microlitros de ATP, e além disso a placa D adicione 90 microlitros de reagente verde de malaquita em cada poço.
Use um sistema de dosagem multicanal automatizado para transferir 40 microlitros de solução de cada poço da placa de adição A para as placas principais um e dois, e da placa B para a placa principal três e quatro. Transfira 20 microlitros da solução de cada poço da placa composta para as placas principais um, placas principais dois, placas principais três e placas principais quatro. Agite as placas por um minuto em um agitador a 200 rpm.
Transfira 20 microlitros da solução de cada poço das placas de adição C para as placas principais um, dois, três e quatro. Agite as placas por um minuto em um agitador a 200 rpm. Incubar as placas a 37 graus Celsius por três horas e, em seguida, transferir 20 microlitros de reagente verde de malaquita da placa de adição D para os poços das placas principais um, dois, três e quatro.
Após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, meça a absorbância da placa a 620 nanômetros em um leitor de placas. A estrutura do verde de malaquita e as reações do reagente A do verde de malaquita com fosfato livre e a reação subsequente com o reagente B são mostradas aqui. Um gráfico padrão para a concentração padrão de fosfato está representado nesta figura.
Aqui, o eixo x representa a concentração livre de fosfato ou pi em micromolares, e a absorbância em 620 nanômetros é representada no eixo y. As barras de erro representam o desvio entre os dois números de amostra. A porcentagem de atividade da ATPase é usada para medir a inibição dose-dependente da proteína pela geldanamicina.
Observou-se que a geldanamicina inibiu a proteína de forma dose-dependente com um valor de IC50 de 0,85 micromolar. Aqui, cada ponto é uma média de duas determinações. O desenvolvimento da cor na placa principal um após a adição do agente verde malaquita é mostrado nesta imagem.
A cor rosa no poço A11 é devido à cor composta. Da mesma forma, o desenvolvimento da cor na placa principal dois é mostrado aqui. A cor rosa no poço A11 é devido à natureza colorida do composto.
O desenvolvimento da cor após a adição do reagente verde malaquita na placa principal três e na placa principal quatro é mostrado aqui. A adição de ATP e reagente verde de malaquita no mesmo intervalo de tempo a cada poço é uma coisa importante a lembrar ao tentar este procedimento.
