Этот протокол поможет определить активность белков АТФазы путем измерения свободного фосфата, образующегося в результате гидролиза АТФ белками. Малахитовый зеленый анализ - это простая, чувствительная, быстрая и недорогая процедура обнаружения неорганических фосфатов. Он подходит для автоматизации и высокопроизводительного скрининга соединений относительно цели.
Этот метод будет играть важную роль в быстром открытии ингибиторов против белка Hsp90, который является важной противораковой мишенью. Для начала насыпьте пипеткой 40 микролитров одномиллимолярного стандарта фосфата в 960 микролитров сверхчистой воды для получения 40-микромолярного фосфатного раствора. Добавьте этот раствор в соответствии с инструкциями производителя, чтобы получить серийное разведение фосфата от 0 до 40 мкмоль.
Затем используйте восемь микролитров дрожжей Hsp90 для измеримой активности АТФазы. Добавьте малахитовый зеленый реагент к заготовке и положительному контролю и проверьте, что разница оптической плотности между заготовкой и положительным контролем после добавления составляет не менее 0,5 и менее 1. Для приготовления АТФ переведите один миллиграмм АТФ во флакон, содержащий 453,39 микролитра сверхчистой воды, чтобы получить четырехмиллимолярный исходный раствор.
Готовьте АТФ в свежем виде, так как со временем он может самопроизвольно гидролизоваться. Добавьте четыре микролитра исходного раствора АТФ в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию 0,2 миллимоля. Добавьте АТФ в качестве последнего компонента в реакцию с помощью многоканальной пипетки, чтобы все реакции начинались одновременно.
Затем приготовьте 10-миллимолярный запас гелданамицина, растворив один миллиграмм в 178,37 микролитрах ДМСО. Используя исходный раствор, приготовьте 4-миллимолярный, 0,8-миллимолярный, 0,16-миллимолярный, 0,032-миллимолярный, 0,0064-миллимолярный и 0,00128-миллимолярный раствор в ДМСО путем серийного разведения. Добавьте два микролитра этих исходных растворов в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию в лунке 0,1 миллимоля, 0,02 миллимоля, 0,04 миллимоля, 0,0008 миллимоля, 0,00016 миллимоля и 0,000032 миллимоля.
Затем подготовьте лунки вместе с лунками, содержащими заготовку и отрицательный контроль. Лунки, содержащие гельданамицин, служат положительным контролем. Подготовьте 96-луночные пластины и подготовьте отдельную лунку для соединений, которые показывают поглощение на 620 нанометрах, чтобы записать поглощение на этой длине волны.
Не показывайте отдельную лунку для гелданамицина, так как гелданамицин не показывает абсорбцию при 620 нанометрах для концентрации, используемой в этом анализе. Обустройте пробирные скважины, добавив в каждую скважину сверхчистую воду. Затем добавьте необходимое количество буфера для анализа и составной раствор, такой как раствор гелданамицина.
Добавьте Hsp90 в соответствующие лунки и встряхивайте пластины в течение двух минут на шейкере при комнатной температуре. Добавьте четыре микролитра раствора АТФ с помощью многоканальной пипетки. Заверните тарелку в алюминиевую фольгу и встряхните в течение двух минут на шейкере при комнатной температуре при 200 оборотах в минуту.
Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Остановите реакцию, добавив 20 микролитров малахитового зеленого реагента в том же порядке, что и АТФ, с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Наконец, измерьте поглощение пластины на 620 нанометрах в считывателе пластин.
В дополнение к планшету А добавьте 90 микролитров пробирного буфера в каждую лунку. Кроме того, в пластину B добавьте 90 микролитров буфера с Hsp90 в каждую лунку. Кроме того, в пластину С добавьте 90 микролитров АТФ, а дополнительно на пластину D добавьте 90 микролитров реагента малахитового зеленого в каждую лунку.
Используйте автоматизированную многоканальную систему дозирования для переноса 40 микролитров раствора из каждой лунки добавочной пластины A на основную пластину одну и две, а пластины B на основную пластину три и четвертую. Перенесите 20 микролитров раствора из каждой лунки составной пластины на основные пластины один, основные пластины две, основные пластины три и основные пластины четыре. Встряхивайте тарелки в течение одной минуты в шейкере при 200 об/мин.
Перенесите 20 микролитров раствора из каждой лунки добавочных пластин C в основные пластины один, два, три и четыре. Встряхивайте тарелки в течение одной минуты в шейкере при 200 об/мин. Инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия в течение трех часов, а затем перенесите 20 микролитров малахитового зеленого реагента из добавочной пластины D в лунки основной пластины один, два, три и четыре.
После 15-минутной инкубации при комнатной температуре измерьте поглощение пластины на уровне 620 нанометров в считывателе планшетов. Здесь показана структура малахитового зеленого и реакции малахитового зеленого реагента А со свободным фосфатом и последующая реакция с реагентом В. На этом рисунке представлен стандартный график стандартной концентрации фосфатов.
Здесь ось X представляет собой концентрацию свободного фосфата или pi в микромолярах, а поглощение в 620 нанометрах изображено на оси y. Полосы погрешностей представляют собой отклонение между двумя числами выборки. Процентная активность АТФазы используется для измерения дозозависимого ингибирования белка гелданамицином.
Было замечено, что гелданамицин ингибирует белок дозозависимым образом со значением IC50 0,85-мкмоль. Здесь каждая точка является средним значением двух определений. На этом изображении показано развитие цвета основной пластины после добавления малахитового зеленого агента.
Розовый цвет в колодце A11 обусловлен составным цветом. Точно так же здесь показано развитие цвета на второй основной пластине. Розовый цвет в колодце A11 обусловлен цветной природой соединения.
Здесь показано развитие цвета после добавления малахитового зеленого реагента в основную пластину три и в основную пластину четыре. Добавление АТФ и малахитового зеленого реагента через один и тот же промежуток времени в каждую лунку является важной вещью, которую следует помнить при попытке этой процедуры.
