פרוטוקול זה יסייע בקביעת הפעילות של חלבוני ATPase על ידי מדידת הפוספט החופשי הנובע מהידרוליזה של ATP על ידי החלבונים. בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני. הוא מתאים לאוטומציה ולסינון בתפוקה גבוהה של תרכובות כנגד מטרתו.
טכניקה זו תמלא תפקיד חשוב בגילוי מהיר של מעכבים נגד חלבון Hsp90, שהוא מטרה אנטי סרטנית חשובה. כדי להתחיל, פיפטה 40 מיקרוליטר של תקן פוספט מילימולרי אחד ב 960 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי לקבל תמיסת פוספט 40 מיקרומולרית. הוסף פתרון זה בהתאם להוראות היצרן כדי ליצור דילול סדרתי של פוספט מ 0-עד 40-micromolar.
לאחר מכן, השתמשו בשמונה מיקרוליטרים של שמרים Hsp90 לפעילות ATPase מדידה. הוסף מגיב ירוק מלכיט לבקרה הריקה ולבקרה החיובית, ובדוק את הפרש הצפיפות האופטית בין הבקרה הריקה לבקרה החיובית לאחר שהתוספת היא לפחות 0.5 וקטנה מ- 1. כדי להכין ATP, להעביר מיליגרם אחד של ATP לבקבוקון המכיל 453.39 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי לקבל תמיסת מלאי ארבעה מילימולרי.
הכינו את ה-ATP טרי, מכיוון שהוא יכול לבצע הידרוליזה ספונטנית לאורך זמן. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי ATP לכל באר כדי לתת ריכוז באר סופי של 0.2 מילימולר. הוסף ATP כמרכיב האחרון לתגובה באמצעות פיפטה רב ערוצית כך שכל התגובות יתחילו בו זמנית.
לאחר מכן, להכין מלאי 10 מילימולרי של geldanamycin על ידי המסת מיליגרם אחד ב 178.37 מיקרוליטר של DMSO. באמצעות תמיסת המלאי, הכן תמיסה של 4 מילימולר, 0.8 מילימולר, 0.16 מילימולר, 0.032 מילימולר, 0.0064 מילימולרית ו- 0.00128 מילימולרית ב- DMSO על ידי דילול טורי. הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסות מלאי אלה לכל באר כדי לקבל ריכוז באר סופי של 0.1 מילימולרי, 0.02 מילימולרי, 0.04 מילימולרי, 0.0008 מילימולרי, 0.00016 מילימולרי ו- 0.000032 מילימולרי.
לאחר מכן, הכינו את הבארות יחד עם הבארות המכילות את הבקרה הריקה והשלילית. הבארות המכילות geldanamycin משמשות כבקרה חיובית. הכינו את לוחות 96 הקידוחים והכינו באר נפרדת לתרכובות המראות ספיגה של 620 ננומטר כדי לרשום את הבליעה באורך גל זה.
אין להראות באר נפרדת עבור geldanamycin, כמו geldanamycin אינו מראה ספיגה ב 620 ננומטר עבור הריכוז המשמש בבדיקה זו. הגדר בארות בדיקה על ידי הוספת מים טהורים במיוחד לכל באר. לאחר מכן, הוסף את הכמות הנדרשת של מאגר הבדיקה ותמיסה מורכבת כגון תמיסת geldanamycin.
מוסיפים את Hsp90 לבארות המתאימות ומנערים את הצלחות במשך שתי דקות על שייקר צלחות בטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של פתרון ATP באמצעות פיפטה רב ערוצית. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ומנערים במשך שתי דקות על שייקר בטמפרטורת החדר ב-200 סל"ד.
דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך שלוש שעות. עצור את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט באותו סדר כמו ATP באמצעות פיפטה רב ערוצית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, למדוד את הספיגה של הצלחת ב 620 ננומטר בקורא לוחות.
בנוסף צלחת A, להוסיף 90 מיקרוליטר של חיץ assay בכל באר. בנוסף צלחת B, להוסיף 90 מיקרוליטר של חיץ עם Hsp90 בכל באר. בנוסף צלחת C, להוסיף 90 מיקרוליטר של ATP, ובנוסף צלחת D להוסיף 90 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט בכל באר.
השתמש במערכת ניפוק רב-ערוצית אוטומטית כדי להעביר 40 מיקרוליטר של תמיסה מכל באר של צלחת חיבור A ללוחות ראשיים אחד ושניים, וצלחת B לצלחת הראשית שלוש וארבע. מעבירים 20 מיקרוליטר של התמיסה מכל באר של הצלחת המורכבת לצלחות ראשיות אחת, צלחות ראשיות שתיים, צלחות ראשיות שלוש וצלחות ראשיות ארבע. נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר ב-200 סל"ד.
מעבירים 20 מיקרוליטר של התמיסה מכל באר של לוחות התוספת C ללוחות הראשיים אחת, שתיים, שלוש וארבע. נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר ב-200 סל"ד. דוגרים על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות ולאחר מכן מעבירים 20 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט מצלחת D לבארות של לוחות ראשיים אחת, שתיים, שלוש וארבע.
לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, מדדו את ספיגת הצלחת ב-620 ננומטר בקורא לוחות. המבנה של מלכיט ירוק והתגובות של מגיב ירוק מלכיט A עם פוספט חופשי והתגובה הבאה עם מגיב B מוצגים כאן. תרשים סטנדרטי לריכוז פוספט סטנדרטי מיוצג באיור זה.
כאן, ציר ה-x מייצג את ריכוז הפוספט החופשי או ה-pi במיקרומולרית, והספיגה ב-620 ננומטר מתוארת על ציר ה-y. קווי השגיאה מייצגים את הסטייה בין שני מספרי המדגם. אחוז פעילות ATPase משמש למדידת עיכוב תלוי מינון של החלבון על ידי geldanamycin.
נצפה כי geldanamycin עיכב את החלבון באופן תלוי מינון עם ערך IC50 של 0.85-micromolar. כאן, כל נקודה היא ממוצע של שתי קביעות. התפתחות הצבע בלוח הראשי אחד לאחר הוספת הסוכן הירוק מלכיט מוצג בתמונה זו.
הצבע הוורוד בבאר A11 נובע מהצבע המורכב. באופן דומה, התפתחות הצבע בלוח הראשי השני מוצגת כאן. הצבע הוורוד בבאר A11 נובע מאופיו הצבעוני של המתחם.
התפתחות הצבע לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט בצלחת הראשית שלוש ובצלחת הראשית ארבע מוצגת כאן. תוספת של ATP ו malachite מגיב ירוק באותו מרווח זמן לכל באר הוא דבר חשוב לזכור כאשר מנסים הליך זה.
